作者：刘永，荆海英，郭立玮，陈峰
【摘要】 目的 探讨复方补肾生精胶囊中制首乌和淫羊藿的指标性成分二苯乙烯苷和淫羊藿苷的提取纯化工艺。方法 对NKA-9、AB-8、D101、X-5、DM130 5种树脂进行筛选，考察上样浓度、树脂用量、药液pH及洗脱剂的乙醇浓度和用量。结果 采用AB-8树脂，上样浓度为原料药0.3 g/mL，树脂用量为2 mL/g原药材，不调药液pH，以5倍原药材量的70%乙醇洗脱。结论 本实验为从复方补肾生精胶囊提取有效成分的工业化生产提供借鉴。
【关键词】 复方补肾生精胶囊；二苯乙烯苷；淫羊藿苷；大孔吸附树脂
Abstract：Objective To study on purication of stilbene glycoside and icarrin with macroporous resin of radix polygoni multiflori praeparata cum succo glycines sotae and herba epimedii of Fufang Bushenshengjing Capsule. Methods To select the best type of resin from NKA-9， AB-8， D101， X-5 and DM130， to observe the factor of the concentration of water-extraction， the volume of resin， pH of water-extraction， the concentration and volume of ethanol. Results Using AB-8 resin， the concentration of water-extraction is 0.3 g/mL， the volume of resin (mL) to the mass of medicinal materials is 2， pH of water-extraction need't change， eluant is 70% ethanol and its volume (mL) is 5 times of the mass of medicinal materials (g). Conclusion This research can provide reference for the extraction of active component from Fufang Bushenshengjing capsule in industrial production. Key words：Fufang Bushenshengjing Capsule stilbene glycoside；icarrin；macroporous resin 复方补肾生精胶囊由制首乌、淫羊藿等5味药材组成，具有温补脾肾、益气生精之功效。大孔吸附树脂是一类人工合成的、具有多孔网状结构和表面活性的高分子材料，是一种有机高聚吸附剂，具有选择性吸附有机化合物的能力，可应用于皂苷、黄酮、蒽醌、生物碱、水溶性酚性成分等的富集，其吸附性能、解吸条件参数因化合物的理化性质不同而不同[1]。经过实验表明，大孔吸附树脂对方中的指标性成分有较好的吸附能力。本试验以复方补肾生精胶囊中制首乌的指标性成分二苯乙烯苷和淫羊藿的指标性成分淫羊藿苷为评价指标，采用大孔吸附树脂纯化工艺进行了如下试验。
1 仪器与试剂
Waters515双泵，2487双波长紫外检测器，WDL-95色谱工作站(大连化学物理研究所生产)。
处方药材均购于南京市药材公司，经南京中医药大学鉴定教研室吴启南教授鉴定，符合2005版《中国药典》(一部)规定。复方补肾生精胶囊由本中心自制。大孔吸附树脂(NKA-9、AB-8、D101、X-5、DM130型，南开大学化工厂)。
二苯乙烯苷、淫羊藿苷(中国药品生物制品检定所)，其他试剂均为分析纯。
2 含量测定方法[2]
2.1 二苯乙烯苷的HPLC测定方法
2.1.1 色谱条件
色谱柱：Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm，淮阴汉邦科技有限公司)；检测波长：320 nm；灵敏度：0.5 AUFS；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；流动相：乙腈-0.1%三氟乙酸溶液(18∶82)。
2.1.2 线性关系考察
精密称定1.44 mg二苯乙烯苷标准品于5 mL棕色容量瓶中，用稀乙醇溶解并定容至刻度，配成浓度为0.288 mg/mL的二苯乙烯苷对照品溶液，依次用稀乙醇稀释，分别制成浓度为0.288、0.144、0.072、0.036、0.018、0.009 mg/mL的样品溶液。结果二苯乙烯苷在0.009～0.144 mg/mL浓度范围内线性关系良好，其回归方程为：Y=43 313 635X-12 921，r2= 0.999 6。
2.1.3 精密度考察
选浓度为0.036 mg/mL的对照品溶液，重复进样6次，RSD=0.71%，符合要求。
2.1.4 供试品溶液的制备
将洗脱液摇匀，精密吸取1 mL，加甲醇4 mL，摇匀，高速离心(10 000 r/min)10 min，取上清液进样。
2.2 淫羊藿苷的HPLC测定方法
2.2.1 色谱条件
色谱柱：Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm，淮阴汉邦科技有限公司)；检测波长：270 nm；灵敏度：0.5 AUFS；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min ；流动相：乙腈-水(30∶70)。
2.2.2 线性关系考察
精密称定1.575 mg淫羊藿苷标准品于5 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成浓度为0.315 mg/mL的淫羊藿苷对照品溶液，依次用甲醇稀释，分别制成浓度为0.315、0.158、0.079、0.039、0.020、0.010 mg/mL的样品溶液。结果淫羊藿苷在0.010～0.315 mg/mL浓度范围内线性关系良好，其回归方程为：Y=59 591X+154 260，r2=0.999 9。
2.2.3 精密度考察
选浓度为0.079 mg/mL的对照品溶液，重复进样6次，RSD=0.68%，符合要求。
转贴于2.2.4 供试品溶液的制备
将洗脱液摇匀，精密吸取1 mL，加甲醇4 mL，摇匀，高速离心(10 000 r/min)10 min，取上清液进样。
3 大孔吸附树脂的预处理与装柱
树脂经初步筛选后，先用乙醇浸泡充分溶胀，然后用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊现象，再用去离子水洗尽醇，最后转入酸碱处理(树脂用4 BV的5% HCl溶液浸泡3 h，以5 BV/h的流速通过树脂层，然后用去离子水以同样流速洗至流出液pH值为中性；再用4 BV的5% NaOH溶液，以5 BV/h的流速通过树脂层，接着树脂注浸泡3 h，然后用去离子水以同样流速洗至流出液pH值为中性即可)。树脂均以湿法装柱。
4 树脂类型的筛选
取NKA-9、AB-8、D101、X-5、DM130树脂各120 mL，湿法装柱，取200 mL水提浓缩液(折合原药材量60 g)5份，缓缓加入各树脂柱，上样后以相同体积蒸馏水洗至流出液近无色，各以400 mL 70%乙醇洗脱树脂柱，收集洗脱液，以二苯乙烯苷、淫羊藿苷的洗脱率为考核指标，测定结果见表1。可知，AB-8树脂的综合评分处于较高水平，故选用其用于树脂工艺的研究。表1 树脂类型筛选结果（略）注：Z=(X+Y)/2，洗脱率(%)=乙醇洗脱液中含量/上样原液中含量×100%。
5 树脂吸附工艺参数正交试验
采用正交设计试验对树脂吸附过程的参数进行优化，采用L9(34)正交表，进行了9次试验。见表2。表2 因素水平表（略）
本正交试验树脂选用AB-8树脂，每个正交试验投料量为80 g原药材量，上样后以相同体积蒸馏水洗至无色，再以500 mL70%的乙醇洗脱，收集洗脱液，以二苯乙烯苷、淫羊藿苷的洗脱率为考核指标，其测定结果见表3、表4。表3 正交试验结果（略）注：Z=(X+Y)/2，吸附率(%)=乙醇洗脱液中含量/上样原液中含量×100%。表4 方差分析表（略）
由表3、表4可知，树脂吸附的最佳工艺为A2B2C1，即上样药液浓度为0.3 g原药材/mL，树脂用量为2.0 mL/g原药材，药液pH值不需调节。
6 树脂洗脱工艺参数的优化
取4份AB-8树脂各180 mL，湿法装柱，再取4份300 mL复方补肾生精胶囊水提浓缩液(折合原药材量90 g)，缓缓流入树脂柱，上样后以相同体积蒸馏水洗至流出液近无色，分别以550 mL 50%、60%、70%、80%乙醇洗脱树脂柱，每90 mL收集一份洗脱液，以二苯乙烯苷、淫羊藿苷的洗脱率为考核指标，其测定结果见表5、表6。表5 树脂洗脱工艺结果(略)注：X=二苯乙烯苷洗脱率(%)，Y=淫羊藿苷洗脱率(%)；洗脱率(%)=乙醇洗脱液中含量/上样原液中含量×100%。表6 树脂洗脱工艺结果(2)
乙醇浓度(略)注：Z=(X+Y)/2。
由试验结果可知，50%的乙醇洗脱液中指标性成分洗脱率低，而60%、70%、80%乙醇洗脱率接近。最终决定70%乙醇为树脂洗脱溶媒，用量为原药材量的5倍体积量。
7 讨论
由本试验结果可知，AB-8树脂可用于复方补肾生精胶囊的精制。AB-8树脂是一种球状、弱极性聚苯乙烯型吸附剂，其结构中仅有非离子化功能基，并附加了亲水基团，基于独特的加工方法，AB-8树脂具有相当大的比表面和适宜的孔径[3]。本方中的指标性成分二苯乙烯苷和淫羊藿苷具有一定的极性和亲水性，生成氢键的能力较强，有利于弱极性树脂的吸附。
二苯乙烯苷与淫羊藿苷分别为处方中主药制首乌和淫羊藿的有效成分。本研究以此两种成分的吸附率与洗脱率的综合评分作为工艺优选的正交实验及平行实验的考察指标，可较单一成分考察更为全面的体现中药复方的药效物质作用。
在安排树脂工艺正交实验时，如将吸附过程与洗脱过程放在一个表中考察，难以充分说明工艺的合理性。不同的工艺步骤，因各自的影响因素均较多，安排在同一个正交试验表内不能充分考察各影响因素的影响。因此，本实验将吸附与洗脱过程分开考察，得到的数据更加可靠。
【参考文献】
[1] 侯世祥，田恒康.大孔吸附树脂在中药复方分离纯化工艺中的应用[J].中药新药与临床药理，2000，11(3)：131－133.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社，2005.123，229.
[3] 林秋凤，王凌云，李药兰，等.AB-8大孔吸附树脂分离长瓣金莲花总黄酮[J].暨南大学学报(自然科学版)，2003，24(1)：55－58.