作者：王琼，汪宁，余黎，陈立军，朱荃
【摘要】 目的 观察中药复方对糖基化终末产物(AGEs)培养下的肾小球系膜细胞增殖以及细胞外基质分泌的影响。方法 MTT法检测肾小球系膜细胞的增殖，碱解法检测细胞上清液中羟脯氨酸的含量。结果 1×10-3、1×10-2、1×10-1 mg/mL的中药复方提取液均能抑制AGEs培养下的鼠肾小球系膜细胞的增殖；能减少AGEs作用下的细胞上清液中羟脯氨酸含量，抑制系膜基质增生。结论 中药复方能抑制AGEs引起的大鼠肾小球系膜细胞增殖以及系膜基质增生，提示此方可能通过阻止AGEs受体信号通路抑制糖尿病肾病的发生发展。
【关键词】 糖基化终末产物；系膜细胞增殖；系膜基质增生；糖尿病肾病；中药复方
Abstract：Objective To observe the effect of the prescription on the progress of mesangial cell proliferation and matrix secreted induced by AGEs. Method The proliferation of glomerular mesangial cell cultured in media was measured by MTT. Hydroxyproline level was measured by alkaline hydrolysis. Result The proliferation of mesangial cells were obviously increased by AGEs (0.25 mg/mL). The proliferation mesangian cells and the hydroxyproline levels were suppressed by the prescription of the concentration 1×10-3， 1×10-2， 1×10-1 mg/mL. Conclusion The prescription could suppress the proliferation of mesangial cells and extracellular matrix induced by AGEs. It suggested that the prescription play a significant role in the prevention of diabetic nephropathy by inhibiting the AGEs receptor. Key words：AGEs；mesangial cell proliferation；matrix secreted；diabetic nephropathy；the prescription 糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最严重的并发症，又称“糖尿病肾小球硬化症”。肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells，GMC)是肾小球中最活跃的反应性细胞，其病理变化在DN的发生和发展中居于中心地位[1]。持续高血糖状态下体内蛋白质发生非酶促糖基化反应和最后形成的糖基化终末产物(advanced glycation end products， AGEs)在DN发生机制中具有重要意义[2]。本实验采用体外AGEs培养的大鼠肾小球系膜细胞，观察健脾益气、补益肝肾、活血利水中药复方对其增殖以及系膜基质增生的影响，探讨延缓肾小球硬化的作用机制，为中医药治疗糖尿病肾病提供依据。
1 一般资料
1.1 试剂和药物 大黄、黄芪、川芎、白术、茯苓、菊花等药材均购自南京中医药大学门诊部，经南京中医药大学王春根教授鉴定。DMEM培养基，Invitrogen Corporation；新生牛血清，杭州四季清血清厂；Thiazolyl 噻唑蓝，Amresco分装，怡成生物，0263；二甲基亚砜(DMSO)，AR级，上海久仡化学试剂有限公司；羟脯氨酸试剂盒，南京建成生物工程研究所，20060615。
1.2 仪器
CO2培养箱，NAPC05410，PERCISION SCIENTIFIC；XSZ-D2倒置显微镜，重庆光学仪器厂；超净工作台，苏州百神科技网络系统有限公司，苏州市洁净技术研究所；Microplate pectrophotometer，SPECTRA max190，美国AD公司；医用离心机，LDZ5-2，北京医用离心机厂。
1.3 细胞株
大鼠肾小球系膜细胞株HBZY21，武汉细胞生物研究所提供。
2 实验方法
2.1 制备中药
各味药按一定比例取100 g，加入70%的乙醇溶液1 000 mL，室温提取48 h，浓缩，低温干燥，得到中药总提物。
2.2 细胞培养
取对数生长期细胞制成单细胞悬液，以100 μL/孔接种于96孔板，细胞数5×104，37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h后，加入无血清的DMEM，于37 ℃、5%CO2培养箱中再孵育24 h，使细胞生长同步进入休止期；弃上清液，再吸弃细胞上清液，同一水平6孔并列，加入不同浓度的AGEs以及中药提取物。
将鼠肾小球系膜细胞种于细胞瓶中，细胞在AGEs条件下培养3周，每3～4 d传代1次。正常组：10% FBS DMEM培养基；AGEs培养组：含0.25 mg/mL AGEs的10% FBS DMEM营养液培养；药物组：在AGEs培养同时分别加入药物，使中药提取液的终浓度分别为1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1 mg/mL。
2.3 细胞增殖的测定[3]
取出细胞培养板，在倒置显微镜下观察，每孔加入MTT 20 μL/孔，于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，加入DMSO液150 μL/孔，室温下将96孔板置于微孔板振荡器上振荡10 min。利用酶标仪波长490 nm检测。
2.4 AGEs的制备
将质量分数为5%的无球蛋白的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)与0.5 mol/L D-葡萄糖共同溶解于0.2 mol/L
磷酸盐缓冲溶液(pH=7.2)中，经0.22 μm滤膜过滤除菌后，置37 ℃培养箱内孵育60 d。糖基化产物孵育结束后，未结合的物质通过对磷酸缓冲盐溶液的广泛透析而除去，然后再用0.22 μm滤膜过滤除菌，备用。
2.5 羟脯氨酸测定(碱解法)
羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可算出其含量。按试剂盒说明书操作。
3 结果
3.1 不同浓度的AGEs对鼠肾小球系膜细胞增殖的影响
取出上述细胞培养板，吸弃细胞上清液，同一水平6孔并列，加入不同浓度的AGEs，终浓度分别为0、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL，于培养箱中分别培养24、48、72、96 h，观察不同浓度AGEs对鼠肾小球系膜细胞增殖的影响。结果见图1。
由以上结果可见，低浓度AGEs对系膜细胞有促进增殖作用，高浓度AGEs(1 mg/mL)对系膜细胞有细胞毒作用。在作用时间上，24、48 h系膜细胞增殖明显，72、96 h时系膜细胞增殖受抑制。在各种浓度中以0.25 mg/mL AGEs对系膜细胞增殖作用明显，因此，我们采用0.25 mg/mL AGEs作用肾小球系膜细胞24 h作为工作条件。
3.2 不同浓度的中药提取液对AGEs培养下的鼠肾小球系膜细胞增殖的影响
取出上述细胞培养板，吸弃细胞上清液，同一水平6孔并列，正常对照组加入DMEM(5.5 mmol/L)，其他各组加入终浓度为0.25 mg/mL的AGEs，药物组分别加入终浓度为1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1 mg/mL的中药提取液。结果见表1。表1 不同浓度的中药提取液对AGEs培养下的鼠肾小球系膜细胞增殖的影响(略)注：与AGEs 组比较，*P&<0.05，**P&<0.01，***P&<0.001(下同)。
3.3 不同浓度的中药提取液对AGEs培养下的细胞上清液中羟脯氨酸含量的影响
取出上述培养3周的大鼠肾小球系膜细胞，以5×104的浓度种入24孔板，1 mL/孔，并相应加入AGEs和药物，同一水平4孔并列，细胞铺满板底后，吸出细胞上清，做羟脯氨酸含量检测。结果见表2。表2 不同浓度的中药提取液对AGEs培养下的细胞上清液 中羟脯氨酸含量的影响(略)
4 讨论
肾小球系膜细胞和细胞外基质(ECM)的病理变化在糖尿病肾病中起重要作用，ECM大量积聚是糖尿病肾病最主要的病理改变[4]。ECM由胶原、非胶原糖蛋白和蛋白多糖构成， Beisswenger等[5]发现糖尿病病理状态下ECM中羟脯氨酸含量显著增加，因此，我们用羟脯氨酸的含量多少反应其在高糖和AGEs作用下ECM的变化。研究表明，用AGEs培养肾小球系膜细胞可导致其增殖及产生ECM增加[6]，说明AGEs可独立于高血糖作用下肾小球系膜细胞诱发DN。AGEs在体内形成后主要是通过形成交联与受体相互作用及增加氧化应激来发挥多种生物学效应，因此，为减少AGEs形成，首先应减少交联的形成，还可用中和抗体抑制AGEs或用抗氧化剂阻止其AGEs受体信号通路。
本方剂是在健脾益气、补益肝肾、活血利水等治疗大法指导下组方的，为探讨其延缓肾小球硬化的作用机制，本实验采用体外AGEs培养的大鼠肾小球系膜细胞，观察中药复方对大鼠肾小球系膜细胞增殖以及系膜基质增生的影响。体外实验结果表明：此方能抑制AGEs引起的肾小球系膜细胞的增殖，减少AGEs作用下ECM中羟脯氨酸含量的增加。提示此方对糖尿病肾病的发生发展有抑制作用，初步验证了中医理论对糖尿病肾病治则的认识，为临床糖尿病肾病方剂的运用提供了客观依据。
参考文献
[1] Schocklmann H O， Lang S， Sterzel R B. Regulation of mesangial cell proliferation[J].Kidney Int，1999，56：1199－207.
[2] Vlassara H. Pathogenic effects of advanced glycosylation：Biologic and clinical implication for diabetes and aging[J].Lab Invest，1994，70(2)：138－147.
[3] 司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安：世界图书出版西安公司，1996. 186－187.
[4] Li JH，Huang XR，Zhu HJ， et al. Role of TGF-beta signaling in extracellular matrix production under high glucose conditions[J]. Kidney Int，2003，63(6)：2010－2019.
[5] Beisswenger P， Land Spiro RG. Studies on the human golomerular basement membrane[J].Diabetes，1973(22)，180－193.
[6] Doi T， Vlassara H， Kirstein M， et al. Recepto specific increase in extracellular matrix production in mouse mesangial cells by advanced glycosylation end products is mediated via platelet derived growth factor[J].Proc N atl Acd Sci USA，1992，89：2873－2877.