早产儿脐血干细胞定向培养免疫体系的分析

作者：吕彩霞 陈敬国 陆俊秀

【摘要】目的 探讨早产儿脐血干细胞定向培养免疫体系的意义。方法 收集30例早产儿，留脐带血标记后进行分离、诱导、分化、扩增培养，培养前后监测早产儿脐血的CD3，CD4，CD8，CD4/CD8;IgG，IgA，IgM水平。结果培养前：CD3(60.32±5.67)%，CD4(24.88±5.02)%，CD8(18.43±4.07)%，CD4/CD8(1.25±0.25)%; IgG(62.67±5.57)g/L，IgA(1.16±0.36)g/L，IgM(1.20±0.20)g/L。培养后分别为(70.32±5.71)%，(58.88±5.21)%，(26.43±4.08)%，(2.01±0.25)%，(70.65±5.61)g/L，(1.82±0.37)g/L， (1.80±0.23)g/L。t检验， P均&<0.05，差异有显著性意义。结论 早产儿免疫功能低下，脐血干细胞可定向培养免疫体系，为干细胞移植作好准备。
【关键词】早产儿 脐血 干细胞 免疫
　　新生儿的免疫系统发育不成熟，功能还很不完善，早产儿更是如此。早产儿由于全身各脏器的发育不够成熟，皮肤表层薄嫩，脐部也是一个开放性的伤口，血清内补体含量低，白细胞的吞噬作用差，血浆丙种球蛋白含量低下，故对各种感染的抵抗力极弱，即使轻微感染也可发展成为败血症。如何增强早产儿的免疫功能已成为目前研究的热点。脐带血是指新生婴儿脐带在被结扎后存留在脐带和胎盘中的血液，含有大量的干细胞，是成体干细胞的主要来源之一，在适宜的体内或体外环境下可分化为免疫细胞，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子调节免疫反应 ，从而发挥免疫重建的功能[1]。由此我们进行了早产儿脐血干细胞定向培养免疫体系的研究，现报告如下：
　　1 对象及方法
　　1.1 研究对象
　　收集30例早产低出生体重儿患者，男19例，女11例，胎龄28-34周，出生体重950-1995g，家属均签字同意接受脐血干细胞定向培养免疫体系的研究。
　　1.2 方法
　　产妇及家属对实验知情同意，实验经医院伦理委员会批准。早产低出生体重儿娩出后，立即断脐，消毒脐带侧，行脐静脉套管插管，脐带血借宫缩力及位差重力作用流入血袋内（内含ACD-B液），摇动混匀，直至无脐血流出为止。将采集的脐带血置于4～10℃冰箱中暂存。将采集所得单人份脐血50ml左右，于4h内，用1.077g/ml Ficoll-Hypaque液分离单个核细胞。吸取界面层白细胞洗涤，用IMDM培养液（加入体积浓度为20%的类标准胎牛血清）采用血细胞计数板调整至细胞浓度为2×108L-1。将调好浓度的细胞悬液置于24孔细胞培养板中培养。每孔加入细胞混悬液1ml。将此培养体系置于37℃、体积浓度为5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养7～1d。每4d补充等量的新鲜培养基。检测扩增效率：细胞培养24，48，72h吹打混匀各孔细胞悬液，取适量悬液MTT法测定细胞增殖率。以只加培养液的培养皿为空白对照。计算细胞增殖率。细胞增殖率=实验组A值/对照组A值×100%。培养前后监测早产儿外周血CD3，CD4，CD8，CD4/CD8;IgG，IgA，IgM水平。检查均在我院肿瘤研究所及检验中心进行。　　CD3，CD4，CD8，CD4/CD8采用美国进口的流式细胞仪检测，仪器型号为COULTEREPICSXL，试剂由法国免疫公司提供。IgG，IgA，IgM应用透射比浊法，采用日本7170A型全自动生化分析仪检测，试剂由上海玉兰生物技术研究所提供。
　　1.3 统计方法
　　采用SPSS13.0统计学软件进行数据统计，用t检验比较差异性。
　　2 结果
　　2.1 T细胞亚群CD3，CD4，CD8，CD4/CD8比值
　　脐血干细胞定向培养免疫体系后较培养前升高(P&<0.05)，其中CD4升高最明显(P&<0.01)，差异有显著性意义，见表1：
　　表1 T细胞亚群检测(%)(x±s)
　　
　　2.2 免疫球蛋白IgG，IgA，IgM水平比较
　　脐血干细胞定向培养免疫体系后较培养前IgG，IgA，IgM均升高(P&<0.05)，差异有显著性意义，见表2：
　　表2 免疫球蛋白水平比较(g/L) (x±s)
　　转贴于 　　 3 讨论
　　早产儿一般未接触过子宫外环境的各种病原，也没有接触过食物蛋白等种类繁多的抗原性物质， 早产儿的血清免疫球蛋白(Ig)中绝大部分为通过胎盘的母亲IgG，而自身IgG的合成能力低下，含量很少，而且出生后随着小儿的生长发育，血循环量的逐渐增加，IgG的浓度迅速下降。早产儿白细胞的生产及储备都比较少，当患有感染及严重疾病时，白细胞消耗增加，吞噬功能和杀菌活性都可能明显降低。早产儿存在着生理性免疫低下，全身各脏器的发育不够成熟，皮肤表层薄嫩，很容易擦伤引发感染；脐部也是一个开放性的伤口，细菌容易在此处繁殖并进入血液；血清内补体含量低，白细胞的吞噬作用差，血浆丙种球蛋白含量低下，故对各种感染的抵抗力极弱，即使轻微感染也可发展成为败血症[2]。
　　随着免疫生物分子学的开展，发现T淋巴细胞由于其功能和表面标志不同，分为6种不同的亚群，其中最重要的是诱导-辅助性T细胞(CD4)及杀伤性-抑制性T细胞(CD8)。CD4T细胞亚群能释放多种淋巴因子，如巨细胞移动抑制因子、细胞活化因子、趋化因子、淋巴毒素、皮肤反应因子等，使局部出现以单个粒细胞浸润为主的炎症反应;CD8T细胞亚群通过分泌T细胞因子即TsF，抑制CD4细胞功能。正常情况下，其在免疫应答过程中互相协调和制约，以形成适度的免疫应答，使之既能清除抗原性异物，又能不损伤机体组织。当CD4细胞功能低下或CD4/CD8低于正常时，机体免疫力下降，易发生感染;若CD4细胞功能增强、CD8细胞功能低下或CD4/CD8高于正常时，则机体易发生过强的免疫应答，引起过敏表现。所以在临床上经常检测患者外周血液中T细胞亚群或CD4/CD8比值，以帮助疾病的诊断或发病机制的研究[3]。本研究中早产儿脐血干细胞定向培养免疫体系前CD4，CD8均低下，且以CD4低下明显，CD4/CD8亦低下，显示患儿细胞免疫功能是低下的。另外CD4细胞还分泌很多因子，如:IL-2，4，5，6，其中IL-4可刺激B淋巴细胞分泌抗体IgG，IgA，IgM等[2]。当CD4功能低下时，IL-4分泌也减少，则抗体IgG，IgA，IgM生成减少，所以早产儿的细胞免疫及体液免疫均低下，容易发生感染，并引起病情反复。
　　虽然每个婴儿脐带中只有少量的血，但这些血液中含有大量的干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下可分化为免疫细胞，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子调节免疫反应 ，从而发挥免疫重建的功能。且来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性[4]。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。本研究显示早产儿脐血干细胞可定向培养免疫体系，改善免疫功能，为干细胞移植作好准备。
参 考 文 献
[1] Qiu L， Meagher R.， Herzig R.H， et al. Ex vivo expansion of CD34+ umbilical cord blood cells in a defined serum-free medium (QBSF-60) with early effect cytokines［J］. J. Hematotherapy && Stem Cell Res， 1999， 8(6): 609-618.
[2] 董永绥.儿科免疫学.特异性免疫和小儿特点[M].武汉:湖北科学技术出版社，1998，7-19.
[3] 曾上勤，周同莆，何志旭.静脉丙种球蛋白对小鼠病毒性心肌炎T细胞亚群!NK细胞及部分细胞因子的影响研究[J].华西医科大学学报，1999，30(3):289-292.
[4]杨国荣译自加藤俊一.脐带血移植的现状和展望［J］.日本医学介绍，2000，21（9）:417.