关于化学损伤对成年大鼠骨骼肌肌卫星细胞的激活作用

作者：邸勇 杨苏民 刘旭 吴玉辉

【摘要】 目的 探讨激活骨骼肌肌卫星细胞的方法，提高肌卫星细胞的产量。方法 取成年Wistar大鼠18只，随机分为6组，给大鼠下肢腓肠肌注射心脏毒素，分别于注射心脏毒素后的当天、注射后1、2、3、4、5 d提取骨骼肌肌卫星细胞并计数，采用免疫荧光方法检测骨骼肌肌卫星细胞的纯度。结果 采用Percoll分离液提纯细胞，纯度能够达到80%。注射心脏毒素后3、4 d骨骼肌肌卫星细胞数最多，与其他时间比较，差异有显著性（F=5.540，q=4.576～5.829，P&<0.05）。之后，细胞数开始减少。结论 对骨骼肌进行一定程度的损伤，可以激活骨骼肌肌卫星细胞，从而提高肌卫星细胞的产量。
【关键词】 卫星细胞，骨骼肌;细胞培养技术；大鼠，Wistar
骨骼肌肌卫星细胞属于成体单能干细胞，具有很强的分化增殖能力，位于骨骼肌纤维的肌膜和基底膜之间，通常情况下处于静息状态。组织损伤（包括体内环境的改变引起的创伤[1]）后，它们很快游走出来，增生并且融合起到修复和再生损伤肌纤维的作用。越来越多的研究证实，病变组织移植骨骼肌肌卫星细胞可以改善症状，为心力衰竭、骨坏死、断肢再生等提供了一种新的治疗途径。本研究旨在寻找合适的方法激活肌卫星细胞，从而提高细胞产量，为实验室研究及临床应用提供细胞来源。　　
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料
　　
　　DMEM/F12（Gibco公司），Percoll分离液（Pharmacia公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所），胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ（Sigma公司），小鼠抗大鼠Myosin、荧光标记羊抗小鼠IgG、多聚赖氨酸（武汉博士德生物工程有限公司），心脏毒素（中鑫东泰纳米基因生物技术有限公司）， 成年Wistar大鼠（青岛市药检中心）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 模型制备 取18只大鼠随机分6组，各3只。下肢备皮消毒后，在腓肠肌处取3个点，每点注射10 mol/L心脏毒素0.1 mL，分别于注射当天、注射后1、2、3、4、5 d处死大鼠。
　　1.2.2 肌卫星细胞原代提取 取处理过的大鼠消毒、固定后，无菌条件下分别取左右下肢腓肠肌，用PBS冲洗血液，剔除结缔组织，将肌肉组织转移到青霉素小瓶，用眼科剪将其剪为肉糜，然后转移至15 mL的离心管，加入1 g/L的胶原酶Ⅱ约2 mL，在37 ℃水浴中慢速搅拌振荡消化约60 min，以150目金属过滤网过滤残余的肌管，并用PBS反复冲洗。取洗净后的肌管加入2.5 g/L胰蛋白酶4 mL消化15min，期间每隔5min震荡1次，加入4mL培养液中和蛋白酶，1 000 r/min离心10 min，弃上清，2 mL培养液重悬沉淀，以体积分数0.20、0.80的Percoll液非连续密度梯度离心法离心，室温、以3000 r/min离心10 min。离心管最上面2 mL为细胞混合液，其下方8 mL为体积分数0.20的Percoll液，最底层2 mL为体积分数0.80的Percoll液。取体积分数0.20与0.80 Percoll 液分界面处的细胞，用无血清培养基1 000 r/min离心清洗3次， 放入未用多聚赖氨酸处理的25 mL培养瓶中，置入37 ℃培养箱中孵育60 min，轻轻摇晃后倾倒出尚未贴壁的骨骼肌肌卫星细胞，计数并重新接种在预先用多聚赖氨酸处理过的培养瓶中。
　　1.3 骨骼肌肌卫星细胞培养及鉴定
　　
　　将纯化后的骨骼肌肌卫星细胞培养96 h后换液，每3 d换液1次，密度达40%时用2.5 g/L 的胰蛋白酶进行消化， 以1∶2 的比例进行传代。取培养第3代的骨骼肌肌卫星细胞生长爬片，室温下通风干燥，40 g/L多聚甲醛固定30 min。吉姆萨染色观察细胞形态，免疫荧光染色计算骨骼肌肌卫星细胞阳性率。
　　1.4 统计学处理
　　
　　采用SPSS软件进行数据处理，数据间比较采用方差分析。
　　2 结果
　　2.1 骨骼肌肌卫星细胞形态和生长情况
　　
　　大鼠骨骼肌肌卫星细胞培养约48 h贴壁，为梭形或纺锤形，呈长轴平行排列，具有明显的方向性和较好的折光性，后呈现多形性，吉姆萨染色可更清楚地显示细胞形态。体外培养的大鼠骨骼肌肌卫星细胞在8代以内生长稳定，超过8代以后骨骼肌肌卫星细胞生长、分化能力下降。
　　2.2 免疫荧光染色
　　
　　以Percoll液非连续密度梯度离心法分离、提纯获得的肌肌卫星细胞纯度能够达到80%。刚分离出的原代骨骼肌肌卫星细胞呈球形， 折光性强；培养2 d时细胞较少融合，多为椭圆形或圆形核的单核细胞，少数亦有双核，呈梭形和纺锤形;培养4 d的肌卫星细胞密度增大，单个细胞间相互交联成网。采用免疫荧光标记羊抗小鼠、小鼠抗大鼠Myosin染色可见约有80%的细胞染色阳性，呈纺锤形，可见绿色荧光信号。
　　2.3 注射心脏毒素后不同时间骨骼肌肌卫星细胞数量比较
　　
　　注射心脏毒素后3、4 d骨骼肌肌卫星细胞数最多，与其他时间比较，差异有显著性（F=5.540，q=4.576～5.829，P&<0.05）。之后，细胞数开始减少。见表1。
　　表1 注射心脏毒素后不同时间骨骼肌肌卫星细胞数比较（略）
　　与注射当天比较，F=5.540，*q=5.202、5.829，P&<0.05;与注射后1 d比较，#q=4.576、5.202，P&<0.05
　　3 讨论
　　
　　骨骼肌肌卫星细胞是成体骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的细胞[2]，呈扁平状，有突起，具有移动性，1961 年由MAURO发现[3]。近年来的研究表明，骨骼肌细胞是一种有丝分裂后细胞，不能进行有丝分裂， 因而动物出生后肌细胞数目不发生明显的变化，但体积和核数目发生很大变化，其原因主要是由邻近的肌卫星细胞融入肌细胞中所致。肌细胞中DNA量及蛋白质合成能力增加， 使肌细胞得以增粗和增长，并且肌卫星细胞对骨骼肌受创伤后肌纤维的再生和修复也起着重要作用。一旦骨骼肌组织受损，肌卫星细胞就会被激活，大量分裂、增殖，相互融合形成肌纤维，填补受损部位。进一步研究表明，骨骼肌肌卫星细胞还具有干细胞抗原 Sca1 和CD34 等干细胞标记， 目前认为肌卫星细胞即肌源性干细胞，属于成体干细胞。最新研究显示，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织， 为干细胞的广泛应用提供了基础。近年来肌卫星细胞常被用于基因载体和组织工程方面的实验研究， 因此建立和完善肌卫星细胞的培养方法、获得高纯度细胞很重要。由于骨骼肌肌卫星细胞具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长以及避免了胚胎干细胞的伦理学争论等优点， 今后定会在组织工程和基因治疗中被广泛应用。由于骨骼肌与心肌同属横纹肌，均起源于中胚层，分化过程有相似之处，自身有再生能力，体外易于培养，有较好的耐疲劳性和耐受缺血能力，已成为最优选的用于坏死心肌治疗的移植细胞之一。朱洪生等[4]报道，体外诱导骨骼肌肌卫星细胞分化为心肌细胞，表达特异性肌钙蛋白T，并可形成缝隙连接。另外也有文献报道，将骨骼肌肌卫星细胞移植入心肌梗死模型可明显改善心功能[4，5]。吕捷等[6]报道，骨骼肌肌卫星细胞可用于基因治疗。由于骨骼肌肌卫星细胞在体内含量少，所以如何有效地增殖肌卫星细胞成为制约此项技术应用的瓶颈。 转贴于 　　本实验采用两步消化法分离细胞，胶原酶对纤维结缔组织有良好的消化作用， 可将肌肉组织松解，利于胰蛋白酶将细胞从基膜消化和分离。分离得到的细胞为肌卫星细胞、成纤维细胞及组织碎片的混合物。其中的组织碎片可以通过换液除去，而成纤维细胞、血管内皮细胞作为细胞杂质很难去除。张玉石等[7]报道，利用流式细胞仪可获得纯度在99%以上的肌卫星细胞。由于实验条件的限制，本实验室采用150目金属网、Percoll细胞分离液[8]、差速贴壁法进行纯化， 得到肌卫星细胞纯度在80%以上。YABLONKA等[8]报道，肌卫星细胞在体外能够分化成肌小管、形成横纹，细胞融合，甚至可见收缩，可通过这种特异性形态学变化鉴定肌卫星细胞。本实验中控制血清浓度高于10%，细胞密度低于60%，未见细胞融合。此外，文献报道鉴定肌卫星细胞的方法包括: 检测骨骼肌特异磷酸肌酸激酶CKMM亚型、结蛋白、肌球蛋白(Myosin)、M钙黏蛋白及α 横纹肌肌动蛋白。本实验采用小鼠抗大鼠单克隆抗体对肌卫星细胞进行鉴定。成纤维细胞与骨骼肌内血管的平滑肌细胞不产生Myosin，由此可与肌卫星细胞鉴别。当然，用多种单克隆抗体进行免疫标记可以更好地对肌卫星细胞进行鉴定。本文结果显示，体外培养的骨骼肌肌卫星细胞开始呈现梭形或纺锤形， Myosin免疫组化检测显示SC呈阳性，证实培养细胞为骨骼肌肌卫星细胞。
　　
　　骨骼肌再生模型主要包括：机械损伤、冰冻或化学诱导损伤。本实验向大鼠腓肠肌注射10 mol/L心脏毒素0.1 mL，心脏毒素与肌细胞膜上的受体结合后，使膜产生小孔，导致肌细胞除极及Ca2+内流，进而使肌细胞受损，可引起80%～90％的肌肉坏死。蛇毒诱导损伤后，从损伤肌管和吞噬细胞中局部释放出生长因子，吸引骨骼肌肌卫星细胞迁移到受损部位，并引起肌卫星细胞在损伤后的2～3 d内广泛增殖；大约在损伤4～5 d后，肌卫星细胞退出细胞周期，或自我更新，或形成分化的具有中央细胞核的肌管。利用这种方法，损伤的骨骼肌组织在损伤后的10 d时间内可以基本恢复。本文结果说明骨骼肌肌卫星细胞增殖高峰是骨骼肌受损后的3、4 d。在制作模型后的3～4 d，也就是在细胞产量最高时收获细胞，可为实验及临床提供细胞来源。本文实验提供了一种简单并可靠的细胞扩增方法。
　　
　　综上所述，骨骼肌化学损伤可作为增加骨骼肌肌卫星细胞产量的一种方法。骨骼肌肌卫星细胞是一种很有前途的成体干细胞，如何使细胞增殖到所需数量是有待解决的问题。而且如何更好地提纯及培养骨骼肌肌卫星细胞也需要我们继续研究和探索。
【参考文献】
　[1]闫凤霞，于向民，潘晓亮，等. 消瘿强肌汤治疗甲状腺功能亢进性肌病大鼠的形态学观察[J]. 青岛大学医学院学报， 2007，43(1):4042.

　　[2]MORGAN J E， PARTRIDGE T A. Cells in focus: muscle satellite cells[J]. Inter J Biochem && Cell Bio， 2003，35：11511156.

　　[3]MAURO A. Satellite cells of skeletal muscle fibers[J]. J Biophys Biochem Cytol， 1961，9:493498.

　　[4]朱洪生，卫洪超. 自体骨骼肌卫星细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究[J]. 中华医学杂志， 2000，80(11):873875.

　　[5]MENASCHE P. Skeletal muscle satellite cell transplantation[J]. Cardiovasc Res， 2003，58(2)：35l357.

　　[6]吕捷， 赵春礼，鲁强，等. 成年动物骨骼肌细胞原代培养及转染外源基因的初步研究[J]. 解剖学报， 2000，31(1):8789.

　　[7]张玉石，李汉忠. 应用Percoll分离纯化组织工程用肌卫星细胞[J]. 中国医学科学院学报， 2005，28(2)：182184.

　　[8]YABLONKA Z， QUINN L S， NAMEROF M. Isolation and clonal analysis of satellite cells from chicken pectoralis muscle[J]. Dev Biol， 1987，119(1):252259.转贴于