关于全反式维甲酸对兔颈动脉内皮损伤后内膜增殖和VEGF及VCAM1表达的影响

　　　　　　 作者：李彦飞 董果雄 张社华

【摘要】 目的 观察全反式维甲酸（atRA）对兔颈动脉内皮损伤后内膜增殖和血管内皮生长因子（VEGF）、血管细胞黏附分子1（VCAM1）表达的影响。方法 新西兰雄性大白兔36只，随机分为6组：治疗A、B组，对照A、B组，假手术A、B组。治疗组和对照组给予高脂饮食并行颈动脉内膜空气干燥术，假手术组手术暴露颈动脉而不损伤内膜，治疗组给予atRA连续灌胃。分别于术后7、28 d处死A、B组动物，取病变血管进行形态学观察。免疫组织化学方法检测病变血管VEGF、VCAM1表达水平。结果 假手术组动脉内膜光滑，无粥样硬化病变及VCAM1表达。对照组术后7 d动脉内膜层出现泡沫细胞，平滑肌细胞增殖，VEGF、VCAM1表达明显增加，28 d时血管内膜明显增厚，有粥样斑块形成。治疗组动脉内膜增生较轻，28 d时内膜面积低于对照组（t=4.770，P&<0.001），动脉粥样硬化病变轻于对照组（H=4.89，P&<0.05），VEGF、VCAM1表达低于对照组（t=3.280～4.288，P&<0.01、0.05）。结论 atRA可抑制兔颈动脉内皮损伤后新生内膜增殖，下调VEGF、VCAM1表达是其作用机制之一。
【关键词】 维甲酸；血管内膜；血管内皮生长因子类；血管细胞黏附分子1
　血管再狭窄是PTCA及支架植入术后主要并发症之一，生物活性因子在这一病理过程中发挥了重要作用，其中血管细胞黏附分子1（VCAM1）可促进单核细胞在血管内皮的聚集、黏附、迁移，而血管内皮生长因子（VEGF）可诱导多种细胞因子、炎症因子的表达促进血管内膜损伤[1]。全反式维甲酸（atRA）是维生素A的天然衍生物，近年来研究显示，它可通过调节基因转录影响细胞周期，抑制血管平滑肌细胞（SMC）的表型转化、迁移、增殖[2～4]，是一种很有潜力的抗血管再狭窄药物。为此，本实验观察了atRA对兔颈动脉内皮损伤后内膜增殖情况及VEGF、VCAM1表达的影响，旨在进一步探讨其抗血管再狭窄作用机制。现将结果报告如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　
　　健康雄性新西兰大白兔36只，4月龄，体质量（2.5±0.12）kg，购自青岛市动物实验中心。atRA（重庆华邦制药公司），胆固醇（上海化学制剂公司），兔抗兔VEGF、VCAM1、SABC试剂盒（武汉博士德公司），Masson三色试剂盒（福州迈新公司）， 奥林巴斯BX50显微镜（日本Olympus公司）。
　　1.2 动物分组及处理
　　
　　36只新西兰大白兔随机分为6组：治疗A、B组，对照A、B组，假手术A、B组，每组6只。治疗组和对照组每日进食150 g高脂饲料（含质量分数0.060的猪油、质量分数0.015的胆固醇、质量分数0.925的基础饲料），假手术组每日喂养150 g基础饲料，均自由饮水。治疗组术前3 d开始每天将atRA 6 mg·kg-1溶于1 mL植物油中灌胃至处死，对照组、假手术组给予等量植物油灌胃。喂养2周后行颈动脉内膜空气干燥术。治疗组、对照组手术严格无菌操作，经耳缘静脉注射250 g/L的乌拉坦1.0 g/kg麻醉动物，取颈部正中纵形切口，分离右颈总动脉长2.0 cm， 选择无分支段，动脉夹夹闭两端，4.5号针头平行穿刺阻断血管的两端，9 g/L的氯化钠注射液冲洗血管腔，向夹闭段的颈总动脉内以120 mL/min流量注入空气，共10 min，管腔内重新注入生理盐水，放开动脉夹，压迫止血，观察血流通畅后逐层缝合。假手术组手术至暴露颈动脉，不行损伤内膜操作。术后各组每天肌注青霉素40万单位，连续3 d。分别于术后第7、28天处死A、B组动物，取病变部位血管等距切分3～5段，40 g/L的中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋。
　　1.3 血管组织形态学测定及病变观察
　　
　　血管标本横截面连续切片，厚度4 μm。切片行苏木精伊红（HE）及Masson染色，显微镜下观察血管结构，进行图像分析，测定每张切片上各个血管截面的内膜面积、中膜面积，计算内膜/中膜面积比，取平均值，用以评定血管狭窄程度。镜下观察术后28 d血管组织切片动脉粥样硬化（AS）病变情况，按照美国心脏病学会对AS的分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）标准，以最重病变为准，对每例动物病变进行分期，计数每组动物各期病变例数。测量AS病变最厚处内弹力板至腔面垂直距离，作为该例动物的最大斑块厚度。
　　1.4 免疫组化染色检测VEGF、VCAM1表达
　　
　　病变血管用SABC三步法进行VEGF、VCAM1免疫组化染色，体积分数0.03的过氧化氢灭酶，微波修复，一抗稀释度均为1∶200，室温孵育1 h，DAB显色，苏木精复染。PBS代替一抗作阴性对照。显微镜下观察蛋白表达情况，VEGF在胞膜及胞浆表达，VCAM1表达于胞膜。随机测量每张切片中6个高倍视野的阳性部位平均吸光度和阳性面积百分比，取其平均值，二者乘积乘以100为阳性表达指数。
　　1.5 统计学处理
　　
　　计量资料数据以±s表示，使用SPSS 11.0统计软件进行t检验或方差分析；计数资料比较采用H检验，P&<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 血管组织形态和AS病变情况
　　
　　实验动物无死亡或患病的情况，切口愈合良好。假手术组颈动脉内膜光滑，7和28 d血管结构无明显差别，内皮细胞完整，呈单层紧贴内弹力板，中膜血管SMC环形规则排列。对照组术后7 d时血管内皮再生，尚未完全覆盖管腔，内弹力板多处断裂，有SMC迁移入内膜，内膜层出现泡沫细胞。28 d时镜下可见内膜层有大量SMC增生，排列紊乱，泡沫细胞聚集，有脂质池、脂质核心形成，中膜亦出现泡沫细胞，动脉内膜明显增厚，并可见粥样硬化偏心性狭窄。治疗组病变与对照组相似，但程度较轻，内膜增厚明显轻于对照组。术后28 d时对照组有1例Ⅰ期AS病变，5例Ⅱ期AS病变，治疗组有5例Ⅰ期AS病变，1例Ⅱ期AS病变，治疗组病变轻于对照组（H=4.89，P&<0.05）。对照组斑块厚度（0.21±0.09）mm，治疗组为（0.09±0.04）mm，治疗组斑块厚度低于对照组，差异有显著意义（t′=2.87，P&<0.05）。
　　
　　术后7 d时治疗组内膜面积、内膜/中膜面积比与对照组比较，差异无显著意义(t=1.004、1.502，P&>0.05)；术后28 d时治疗组内膜面积、内膜/中膜面积比均低于对照组（t=4.770、5.092，P&<0.001）。术后7、28 d时各组间中膜面积比较无明显差异(F=1.723、1.234，P&>0.05）。见表1。
　　2.2 atRA对血管VEGF、VCAM1表达的影响
　　
　　假手术组动物术后7、28 d仅血管内皮有微量VEGF表达；对照组术后7 d 在血管新生内皮层和中膜SMC有VEGF表达，部分融合成片，术后28 d时阳性表达指数下降，新生内膜、中膜、外膜均有表达，以新生内膜深面靠近内弹力板处、粥样硬化斑块部位为主，可见泡沫细胞表达。治疗组术后7、28 d时VEGF表达部位及规律与对照组相同，但阳性表达指数低于对照组（t=3.280、4.288，P&<0.01）。见表2。
　　
　　假手术组血管未见VCAM1表达，对照组术后7 d时血管内膜、中膜可见大量棕黄、棕褐色颗粒，呈网格状，部分融合成片，以内膜为主，内皮细胞及泡沫细胞表达明显；术后28 d时表达下降，血管各层均可见棕黄色物质，以新生内膜深面、粥样硬化病灶处为主。治疗组血管VCAM1表达部位及规律与对照组一致，但阳性表达指数明显低于对照组（t=2.818、3.703，P&<0.05）。见表2。
　　表1 各组内膜面积、中膜面积及内膜/中膜面积比结果比较（略）
　　表2 atRA对血管VEGF、PCNA阳性表达指数影响（略）

　　3 讨论
　　
　　VCAM1是与炎症有关的重要的黏附分子，其配体是整合素家族的VLA4，通过与VLA4结合介导细胞与细胞之间的黏附。VCAM1参与AS形成过程中所涉及的炎症细胞聚集，促进单核细胞黏附、迁移并转化为巨噬细胞，同时还可促进T淋巴细胞及B淋巴细胞从血流中向内皮细胞的黏附。VCAM1在PTCA术后再狭窄中也发挥了重要作用，它可刺激SMC迁移，加重单核巨噬细胞浸润及内膜增殖，而应用VCAM1抗体能使小鼠动脉损伤模型的新生内膜增厚明显减轻[5，6]。
　　
　　本实验中对照组血管内皮细胞、SMC和泡沫细胞VCAM1表达明显增高，局部呈现炎症状态，这些细胞的黏附、迁移功能增强，促进了血管内膜增殖及AS病变形成。治疗组在应用atRA后明显抑制了SMC的迁移、增殖，减轻了内膜增厚和AS进展，这与其下调损伤血管的VCAM1表达有关。研究结果表明，atRA能抑制NFκB的活化，而NFκB是VCAM1重要的转录调节因子，NFκB活化可使其过度表达，引起炎症反应[7]。血管内膜损伤可引起多种细胞因子分泌，包括TNFα、IL1β等，atRA还能抑制TNFα诱导的VCAM1表达[7]。atRA抑制VCAM1表达可能是这些机制的综合结果。
　　
　　VEGF是重要的促有丝分裂素，可刺激内皮细胞的增生、迁移，促进血管内皮修复，而血管内皮的完整对抑制再狭窄和血栓有益。但VEGF还是重要的血管通透性因子，可导致血浆蛋白渗漏，炎症细胞在局部聚集，促进AS斑块内微血管形成，使斑块不稳定性增加[8]。另外，其还可诱导单核细胞的活化、迁移及多种细胞因子、炎症因子的表达，促进血管内膜损伤[1]。所以，从某种意义上说VEGF也是一种促炎症因子。
　　
　　本实验结果显示，在高胆固醇饮食和内膜损伤刺激下，血管的内膜、中膜VEGF异常表达，术后28 d时内皮细胞已完全覆盖腔面。VEGF处于一种过度表达状态，这种持续过高的分泌状况诱导了其他炎性因子的作用，加剧了内膜的损伤和内膜增殖。本实验中atRA显示了抗内膜增殖和AS作用，这一作用与atRA抑制VEGF的表达，减轻VEGF导致的炎症细胞聚集及炎症因子表达有关。atRA下调VEGF表达可能是在基因水平抑制VEGF转录，以及抑制其他促VEGF分泌因子作用的综合结果[9]。
　　
　　本实验结果表明，在高脂饮食及内皮损伤等因素作用下，血管组织VEGF和VCAM1持续、过多地表达，与多种生物活性因子相互作用，最终促进了内膜过度增殖及血管再狭窄病变形成。应用atRA能明显抑制AS进展和血管再狭窄的发生，而抑制VEGF和VCAM1表达是其机制之一。

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