关于AAVhTGFβ1基因体内转染羊椎间盘对髓核细胞Ⅱ型胶原的影响

【摘要】 目的 观察腺相关病毒(AAV)介导人转化生长因子β1（hTGFβ1）基因体内转染羊椎间盘后，对其Ⅱ型胶原的影响。方法 SPF级山羊8只，共取椎间盘32个，实验组、对照组各16个。实验组椎间盘显微注射AAVhTGFβ1，对照组注射磷酸盐缓冲液（PBS）。术后4周对山羊腰椎间盘行免疫组织化学观察，采用VIDAS图像分析系统进行半定量分析。结果 实验组Ⅱ型胶原表达明显高于对照组，差异有统计学意义（t=3.521，P＜0.05）。结论 AAVhTGFβ1基因体内转染后能提高椎间盘细胞Ⅱ型胶原的表达。

【关键词】 转化生长因子β 胶原Ⅱ型 椎间盘

［ABSTRACT］ObjectiveTo observe the effect of hTGFβ1 encoding gene mediated by adenoassociated virus (AAV) on the collagen Ⅱof the nucleus pulposus cells of intervertebral disc of goat.MethodsThirtytwo intervertebral discs from eight goats were evenly pided into two groups: group Ⅰ treated with AAVhTGFβ1 injection and group Ⅱ with 0.01 mol/L PBS injection. Four weeks after treatment， immunohistochemistry staining and VIDAS analysis were applied to semiquantitatively analyze the expression of collagen Ⅱ.ResultsThe expression of collagenⅡin group Ⅰ was significantly stronger than that of group Ⅱ （t=3.521，P&<0.05).ConclusionTransfer of AAVhTGFβ1 into the intervertebral discs could enhance the expression of collagenⅡin the nucleus pulposus.

　　［KEY WORDS］transforming growth factor beta; collagen typeⅡ; intervertebral disk

　　腰椎间盘退变是腰背痛的重要病因，它是一个复杂的过程，其发生的病因和机制目前尚有较大争议。目前的治疗手段主要是对症治疗，包括保守治疗和手术治疗，前者常出现复发，而后者为有创治疗，会破坏脊柱的稳定性和完整性，伴有许多并发症[1]。随着分子生物学的迅速发展，基因治疗为我们在细胞、分子水平上延缓或逆转椎间盘退变提供了可能。基因治疗是将调解基因导入椎间盘细胞中，以期获得长期疗效。1997年WEHLING等[2]首先提出了转基因逆转椎间盘退变的设想，将目的基因转染体外培养的牛椎间盘软骨终板的软骨细胞。1999年NISHIDA等[3]证实，腺相关病毒介导的人转化生长因子β1(AAVhTGFβ1)基因可以成功导入兔椎间盘中，基因表达蛋白合成持续3个月未发现明显减少，转染的椎间盘较对照椎间盘合成hTGFβ1增多，蛋白多糖合成率增高。本研究采用AAVhTGFβ1体内转染羊椎间盘髓核细胞的方法，观察其对Ⅱ型胶原合成的生物学效应。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　健康成年SPF级山羊8只，由青岛大学医学院附属医院动物实验室提供，雌雄各4只，（10.5±0.5）月龄，平均体质量为（30.2±3.8）kg。随机分为两组，每组4只。在标准饲养条件下适应性饲养2周。AAVhTGFβ1由北京本元正阳基因技术有限公司提供。Collagen TypeⅡ抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 实验方法

　　术前禁饮食36～48 h，术前将阿托品0.03～0. 05 mg/kg、氯胺酮10 mg/kg及地西泮10 mg肌肉注射，氯胺酮1～2 mg/kg静脉缓慢推注给药。山羊取右侧卧位，经腹膜后入路暴露腰椎间盘，任意选相连的4个椎间盘，实验组对应髓核用显微注射器各注射AAVhTGFβ1 50 μL，对照组对应髓核注 射磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L）50 μL，在相应椎体的横突用金属线作标记，逐层缝合。动物术前及术后3 d肌注青霉素160万单位，术后室内休养3 d。第4周处死山羊，共得到椎间盘32个，实验组、对照组各16个。立即用40 g/L的多聚甲醛固定1周，EDTA脱钙处理，石蜡包埋，切成6 μm厚的切片。免疫组织化学染色后光学显微镜观察，VIDAS图像分析系统测定其阳性产物的平均吸光度值，用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。

　　2 结　　果

　　实验组Ⅱ型胶原免疫组化染色结果显示，椎间盘髓核中央区出现阳性细胞，且阳性细胞数较多、染色较深。对照组Ⅱ型胶原免疫组化染色结果显示，椎间盘髓核中央区出现阳性细胞，且阳性细胞数较少、染色较浅。实验组阳性细胞的平均吸光度值为0.702±0.150， 对照组为0.507±0.163，两组比较差异有显著性（t=3.521，P＜0.01）。

　　3 讨　　论

　　椎间盘单元是由软骨终板、髓核和纤维环三部分构成。其上下两端为软骨终板，有许多微孔，是髓核营养代谢重要通路；中央有富含水分的糖胺多糖构成髓核；周围有胶原纤维上下垂直交叉构成呈同心圆排列的纤维环。髓核是全身最大的无血管组织，其营养物质的吸收和代谢产物的排除主要依靠软骨终板通路和纤维环外周通路。椎间盘退变是从椎间盘细胞开始的，随年龄增长髓核细胞凋亡不断增加，退变逐渐加重[4]。椎间盘退变的生物学治疗研究主要集中于3个方面，各有其局限性。细胞因子直接注射治疗，半衰期短，不能长期在体内发挥作用，需要多次局部注射；组织工程细胞移植治疗，难于获得大规模、具有再生活力的种子细胞是其关键性的限制因素[5]；载体介导的基因治疗，取决于安全高效载体的研究进展。

　　正常情况下髓核几乎不含Ⅰ型胶原，主要为Ⅱ型胶原，占椎间盘胶原总量的40%，多呈任意排列，胶原纤维中间间隔有大量的蛋白多糖和水分；随着椎间盘的退化Ⅱ型胶原的表达呈下降趋势，聚合型蛋白多糖水分降低。TGFβ是一种多功能的生长因子超家族， 目前已发现TGFβ1～TGFβ5 共5 种异构体，TGFβ1具有多重生物学效应，能促进未分化和分化早期的软骨细胞增殖，并刺激Ⅱ型胶原核蛋白多糖的合成，是椎间盘退变基因治疗中最为常用的细胞因子之一。但由于蛋白的融合及灭活，外源性生长因子半衰期短，体内直接注射只起到短期的作用，常需反复大剂量使用，通过何种方法使生长因子持续高效发挥作用一直是基因治疗和组织工程学研究的关键问题。本实验采用AAVhTGFβ1基因体内转染羊椎间盘的髓核细胞，腺相关病毒是长为4.7 kb单链DNA基因组的人类微小病毒，在19号染色体上可以稳定结合治疗基因，可以感染分裂期和非分裂期的多种细胞。无病毒基因表达和延长的转基因表达是其被广泛研究的主要原因。

　　本研究实验组椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原的表达高于对照组，差异具有统计学意义，提示AAVhTGFβ1基因转染椎间盘髓核细胞的方法可以提高Ⅱ型胶原的表达，为TGFβ1基因在延缓椎间盘退变的进程中发挥积极作用提供了一定的理论依据。

【参考文献】
[1]刘海飞，王德春，胡有谷. 椎间盘退行性变的生物学治疗研究进展[J]. 中华外科杂志， 2006，44(4):284287.

[2]WEHLING P， SCHULITZ K P， ROBBINS P D， et al. Transfer of genes to chondrocytic cells of the lumbar spine. Proposal for a treatment strategy of spinal disorders by local gene therapy[J]. Spine， 1997，22(10):10921097.

[3]NISHIDA K， KANG J D， GILBERTSON L G， et al. Modulation of the biologic activity of the rabbit intervertebral disc by gene therapy: an in vivo study of adenovirusmediated transfer of the human transforming growth factor beta 1 encoding gene[J]. Spine， 1999，24(23): 24192425.

[4]刘勇，胡有谷，宁斌. 人退变椎间盘细胞培养及细胞凋亡的研究[J]. 青岛大学医学院学报， 2005，41(3):218219.

[5]宁斌，胡有谷，刘勇，等.成人退变椎间盘细胞微载体培养的形态学观察[J]. 青岛大学医学院学报， 2005，41(3):205209.