脐血单个核细胞的免疫学分析进展

【关键词】 脐血 单个核细胞 免疫学 综述
　　造血干细胞移植（HSCT）已成为治疗多种血液病、某些恶性实体肿瘤、部分遗传性疾病、重症免疫缺陷等疾病的最有效措施之一。骨髓、外周血和脐血是造血干细胞的三大来源。但异基因骨髓移植（alloBMT）或外周血干细胞移植（alloPBSCT）受HLA匹配供者来源的限制，自体造血干细胞移植又受到干细胞体外净化等问题的困扰，而脐血造血干细胞因其广泛的来源、较强的增殖分化能力及较弱的免疫原性而日益受到重视。临床应用已证实脐血造血干细胞移植对于重建或改善骨髓造血功能有良好疗效，具有临床应用价值［1］。脐血单个核细胞（CBMNC）是脐血移植的有效成分，因此，本文拟就CBMNC的免疫学特点作一综述。
　　1 脐血造血干祖细胞（HSPC）的免疫学特性
　　HSPC是一类具有高度自我更新和定向分化特征的原始细胞，目前尚无直接检测HSPC的方法。CD34被公认为是骨髓、外周血以及脐血的HSPC的表面标志。文献报道，脐血中CD34+细胞占有核细胞总数的2%，与成人骨髓相当（2.1%），高于外周血（0.5%）［2］。近年来，应用单克隆抗体及流式细胞技术研究发现，体内长期植活细胞仅为表达CD34+CD38-OR-Thy-的细胞群，因此检测CD34+CD38-细胞标志，可间接估计HSPC含量。
　　脐血CD34+细胞亚群分析显示，脐血造血干细胞中的CD34+CD38-细胞的百分比明显高于外周血和骨髓，提示脐血造血干细胞中含有较多更为原始的造血细胞。
　　体外细胞培养方法测定脐血中HSPC，结果显示，脐血除了含有粒单集落形成单位（CFUGM）外，还含有爆式红系集落形成单位（BFUE）、淋巴系集落形成单位（CFUL）、巨核系集落形成单位（CFUMeg）和混合集落形成单位（CFUMix）。单位数量脐血中CFUGM的含量高于动员后的外周血12～16倍，相当于或超过骨髓；脐血中的BFUE、红系集落形成单位（CFUE）的数量也高于成人外周血及骨髓。另外，脐血样本形成的集落也比骨髓形成的集落大，显示脐血CD34+CD38-细胞群克隆形成能力较成人外周血及骨髓强。
　　研究发现，尽管脐血中HLADR+和HLADR-两群细胞有97%的细胞处于G0或G1期，但两群细胞增殖很快，经含细胞因子液体培养36 h后仅有50%的细胞处于G0或G1期，而骨髓中80%HLADR+细胞和90%HLADR-细胞处于G0或G1期，经36 h培养后仍有80%处于G0或G1期。表明脐血中CD34+CD38-细胞对集落生长刺激因子具有更高的敏感性，细胞生长周期更短。
　　端粒是在所有真核生物染色体末端的富含G′C的重复DNA序列，在细胞分裂期间端粒重复序列的丢失被认为可能是细胞衰老的机制。应用DNA印迹法、荧光原位杂交法研究发现，脐血干细胞的端粒平均长度明显较骨髓干细胞的端粒长。另外，脐血HSPC的端粒酶活性高于骨髓及外周血HSPC，脐血HSPC低表达甚或不表达细胞凋亡配基CD95/Fas，因此脐血的造血增殖潜能要高于骨髓，其移植存活期比骨髓更长、更稳定。
　　2 脐血T淋巴细胞的免疫学特性
　　脐血T淋巴细胞在移植物抗宿主病（GVHD）、移植物抗白血病（GVL）和免疫调节中发挥重要作用。研究表明，脐血T淋巴细胞在表型、功能、免疫效应分子及许多膜受体的表达等方面，与成人外周血T淋巴细胞存在许多差异。脐血成熟T细胞数量不足，T细胞表面抗原标记和T细胞亚群发育不成熟，且呈异质性［3］。
　　脐血CD4+、CD8+、CD3+淋巴细胞绝对数量低于成人外周血，而CD4+/CD8+比值较外周血高，CD8+T细胞数低于外周血。体外去除CD8+T细胞，定量输入CD4+T细胞的供体淋巴细胞能够有效地介导针对慢性粒细胞性白血病（CML）的GVL，使BMT后复发的病人达到再次诱导缓解的效果，而GVHD的发生率较低［4］。这提示CD8+T细胞在介导人类GVHD中最为重要，而CD4+T细胞则可能有GVL效应。所以脐血CD8+T细胞数较低可能是脐血移植后GVHD发生率低、程度轻的原因之一。
　　CD45RA+T细胞是未经抗原刺激的原始T细胞，在受抗原刺激后转化为记忆性细胞，即CD45RO+T细胞。文献报道脐血中以CD45RA+T细胞为主，而CD45RO+T细胞显著低下。CD45RA+T细胞没有辅助功能，主要起免疫抑制作用。致使脐血移植后GVHD发生率低，但同时有可能降低GVL。
　　CD26是T细胞的活化抗原，现已知脐血中以CD26+CD45RA+T细胞为主（超过88%），而CD26+CD45RO+T细胞不到2%，成人外周血中CD26+CD45RA+T细胞占34%，而CD26+CD45RO+T细胞占48%。SEIJI等［5］的研究表明，CD26与CD45RA的共调节可能导致脐血T细胞通过CD26的活化能力下降。
　　脐血T细胞与成人外周血T细胞免疫功能相差很大。脐血中的T淋巴细胞受1次、2次和3次异体抗原刺激后，相应的细胞毒活性比成人T细胞活性低，并且越来越低，而成人T细胞则逐渐增高。在最初的混合淋巴细胞培养中，脐血和成人T细胞均能产生很强的增殖反应，受第2次刺激后，脐血T细胞出现无反应状态，其增殖反应、细胞毒效应均较成人外周血T细胞弱，而活化诱导的细胞凋亡反应较强［6］，提示脐血中T细胞对于异体抗原能产生耐受性。
　　与成人T细胞相比，脐血T细胞受刺激后分泌更高水平的IL10，但是分泌较低水平的许多其他细胞因子，包括IL2、IL4、IL8、IFNγ、TGFβ和TNFα［7］。脐血IL2、IL4、IL8和IFNγ等细胞因子含量较低，提示脐血中幼稚、未分化成熟的免疫细胞不能产生足量的细胞因子。脐血淋巴细胞产生细胞因子的细胞群主要为CD4+CD45RA+，而外周血则为CD4+CD45RO+和CD8+CD45RO+细胞群。实验表明，脐血T细胞对细胞因子或化学因子刺激应答反应较迟钝，且分泌细胞因子的能力较成人外周血明显低下。这主要是脐血T细胞的蛋白合成能力、细胞因子mRNA丰度以及转录速度较成人T细胞低。脐血T细胞其他免疫效应分子含量亦与外周血T细胞不同，穿孔素是细胞毒性T细胞发挥细胞毒作用的重要效应分子，文献报道脐血T淋巴细胞穿孔素的含量与成人外周血T细胞相比显著下降。
　　SATO等［8］研究结果表明，脐血T细胞和成人外周血T细胞对细胞因子反应性不同可能由于它们的受体不同。HODGE等［9］在研究T细胞IL2产生的同时研究IL2R表达情况，发现脐血T细胞和成人外周血T细胞IL2Rα和IL2Rγ比例无差别，但脐血T细胞表现出低IL2Rβ表达，且上调延迟。有研究证实，脐血T淋巴细胞不表达IL1R。
　　另外，在T细胞亚群中有一类特殊的细胞亚型，它具有自然杀伤（NK）细胞受体和T细胞受体且显示NK细胞和T细胞两方面的性质，能恒定表达Vα24JαQTCR及识别CD1d表达的糖酯，这就是NK T细胞。NK T细胞依赖其接受多克隆激活后产生的IL4［10］，在抑制TH1细胞介导的自身免疫性疾病和GVHD中起重要作用。与成人外周血相比，脐血中NK T细胞的含量显著减少［6］。脐血中的NK T细胞具有较低的免疫原性和较高的分化潜能。成人的NK T细胞有记忆力，呈寡克隆增生，在初次刺激后产生T0型因子。虽然脐血中的NK T细胞也表现出记忆性表型（CD45RO+CD62L-），但有其自身的免疫学特性：①表现活化的标志，如CD25；②是多克隆性的；③在初次刺激后不产生细胞因子［11］。可见，虽然脐血NK T细胞也表现出记忆性，但功能仍不完善。
　　脐血T淋巴细胞的上述免疫学特性决定了脐血的免疫功能，尤其是特异性细胞免疫功能是不成熟的。
　　3 脐血B淋巴细胞的免疫学特性
　　与成人外周血相比，脐血B淋巴细胞的表型、功能相对不成熟。
　　脐血中B细胞约50%为原始型，由于宫内隔绝环境长期缺乏特异抗原的刺激，不能转化为产生抗体的浆细胞，亦几乎不能产生IgG和IgA，只能产生一定量的IgM和IgD。
　　CD5+、CD19+是脐血B细胞不成熟亚群标志，CD10是早期B细胞的免疫标志。研究显示，脐血B淋巴细胞数量与成人外周血相当，但不成熟亚群CD5+CD19+和CD10+CD19+的比例显著比外周血高。正常情况下，成人外周血B细胞仅少量表达CD1C、CD38、CD5、CD23抗原，而这些抗原在脐血B淋巴细胞均高表达。功能分析显示，脐血B淋巴细胞受IL2、IL3、有丝分裂原等刺激后的增殖反应较弱。脐血缺乏表达膜IgG和IgA的循环B淋巴细胞；脐血B淋巴细胞所有类型重链的mRNA表达水平仅为成人外周血细胞的1/10，提示脐血B淋巴细胞不能形成IgG和IgA型浆细胞，可能是因为缺乏合适的前体细胞。另外，脐血B淋巴细胞CD27表达缺陷及没有合适T细胞辅助可能也是其功能不成熟的原因。
　　由此可见，脐血的体液免疫功能也是不成熟的。
　　4 脐血NK细胞和LAK细胞的免疫学特性
　　NK细胞是脐血移植后首先恢复的细胞群之一［12］。宿主NK细胞介导抗移植物反应，而供体NK细胞的异基因反应降低了白血病的复发率［13］，并保护病人免于GVHD的损害［14］。
　　脐血淋巴细胞绝对数比成人外周血高2～3倍，大颗粒淋巴细胞（80%～90%是NK细胞）绝对数也明显增高。COHEN等［15］研究发现，脐血富含原始的CD16+CD56+NK细胞，其具有重要的增殖能力与细胞毒活性，能被IL12或IL15诱导增殖，以达到强有力的移植物抗白血病效应。
　　与骨髓来源的NK细胞比较，脐血NK细胞与LAK细胞有以下特点：①脐血NK细胞对Daudi靶细胞的致死毒性作用强；LAK细胞有相当高的诱导YAC1靶细胞凋亡的毒性，而骨髓源的LAK细胞无此作用［16］；②新分离的脐血NK细胞可以裂解肿瘤细胞，在多种细胞因子作用下可以分化成LAK细胞，尽管脐血NK细胞产生的细胞毒性低于成人外周血NK细胞，但结合K562细胞的能力相当；③加入IL2或IL2R进行培养，脐血NK细胞活性可达到外周血NK细胞水平，且可增加穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B的mRNA表达，从而产生LAK细胞［17］，进行Westernblotting证实骨髓的NK细胞无颗粒酶B蛋白的表达；④脐血NK细胞能够激活颗粒酶/穿孔素溶解途径及Fas/FasL活动，这被认为与脐血移植后急性GVHD的低发生率有关［12］；⑤研究表明，脐血诱导产生的LAK细胞可裂解新鲜的白血病细胞；⑥脐血NK细胞杀伤性抑制性受体（KIR，包括CD158+a/CD158+b）CD158+b表达明显低于外周血NK细胞［18］。
　　有学者认为脐血的细胞毒作用主要由NK而非CD8+T细胞介导。此外，BERTHOU等研究发现，穿孔素在脐血CD8+T细胞中表达量极低，而主要表达在CD3+NK细胞和其他不成熟NK细胞亚群，并认为脐血细胞毒作用主要由穿孔素阳性NK细胞，而非CD8+T细胞介导。由此可见，在脐血干细胞移植（UCBSCT）后的GVL作用中，免疫系统非特异反应细胞——NK细胞起重要作用[19]。
　　5 脐血抗原提呈细胞的免疫学特性
　　树突状细胞（DCs）是至今所知的功能最强的专职脐血抗原提呈细胞（APC），但DCs在组织中含量甚微，仅占外周血单个核细胞的1%以下。目前，DCs主要由CD34+HSPC或CD14+单个核细胞在细胞因子作用下诱导获得。人DCs的主要特征性标志为CD1a、CD11c及CD83，DCs还表达MHCⅡ分子，共刺激分子CD80及CD86，黏附分子CD54等。脐血DCs的经典培养方法是用GMCSF/TNFα诱导CD34+HSPC生成。SORG等［20］研究表明，脐血中DCs占单个核细胞的0.2%～0.4%，主要表达HLADR、CD4、CD11a、CD45RA、CD50、CD54、以及CD123，低表达CD58、CD102、CD116，而不表达CD11c、CD80和CD86，显示脐血中DCs数量少，并呈现不成熟细胞表型。然而亦有研究显示，新鲜脐血与外周血比较，其CD34、CD38、CD1a阳性细胞数明显高于外周血，CD83、CD11c、CDw123等抗原阳性细胞数亦高于外周血。提示新鲜脐血中含有更多的CD34+细胞和DCs，体外应用细胞因子诱导将可能产生更多的功能性DCs。ZHENG等［21］研究结果表明，GMCSF和IL4诱导脐血和外周血的增殖能力是相同的，但脐血获得高表达CD80、CD83、CD1a DCs时间要较外周血早。更多的研究表明，脐血来源DCs同外周血及骨髓来源DCs一样，具有较强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖及激发T淋巴细胞抗肿瘤免疫反应的功能。

　　除IL1外，APC产生的细胞因子的量明显低于成人细胞。脐血来源的单核细胞IL1 mRNA、IL1蛋白产量与成人细胞一致；巨噬细胞被脂多糖激活后，IL2、IL15 mRNA转录、翻译速率虽与成人细胞一致，但是脐血APC产生的IL2、IL15蛋白量却不如成人血相应细胞。因而，由于共刺激因子产生不足，脐血APC的抗原提呈能力较成人APC明显低下。
　　综上所述，由于脐血HSPC含量丰富、细胞较原始、增殖分化能力较强，移植后能够长期重建造血。CBMNC的免疫原性较弱，导致UCBSCT后GVHD发生率低且程度轻，而GVL作用则因存在NK、LAK活性而保留。事物总存在两面性，也正是由于CBMNC的上述特性，UCBSCT后有造血与免疫重建延迟的缺点。相信随着研究的进一步深入，UCBSCT将扬其长而避其短，有着更加广阔的前景。
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