RNA干扰靶向抑制胃癌SGC7901细胞COX2基因和蛋白表达的分析

　　　　　　　　　　 作者：李玉明 蒋 宏 吴峰阶 于兴泉 宋丙潭 刘春远

【摘要】 目的 利用RNAi技术，以胃癌SGC7901细胞COX2作为靶点，建立有效的RNA干扰方法，为胃癌及其复发和转移提供基因治疗的新方法。方法 设计并合成6条COX2 siRNA和1条阴性对照siRNA，用3种不同的转染试剂分别转染胃癌SGC7901细胞，荧光定量PCR和Western blotting检测胃癌SGC7901细胞中COX2基因和蛋白的表达。结果 TOPtranfection能够有效介导报告基因DNA（pcDNA/lacZ）转染SGC7901细胞，细胞转染率为56.0%，明显优于其它两种转染试剂，转染的pcDNA/lacZsiRNA对报告基因产生显著抑制；TOPtranfection介导的COX2 siRNA有效抑制了胃癌细胞COX2 mRNA表达，与对照组相比抑制效率达90%以上，最高达98.3%，同时抑制胃癌SGC7901细胞COX2蛋白表达71.5%。结论 TOPtranfection能够有效介导COX2siRNA转染SGC7901细胞；靶向COX2的RNA干扰能有效抑制胃癌细胞中COX2基因和蛋白的表达，为胃癌的治疗以及抑制胃癌复发和转移提供基因治疗新的靶点和方法。
【关键词】 RNA干扰；环氧酶2；胃癌；基因治疗
　　【Abstract】 Objective To establish an efficient method of RNA interference on COX2 of gastric cancer cell line SGC7901， and provide a new pathway for gene therapy of gastric cancer and its recurrence and metastasis.Methods Six pieces of COX2 small interference RNA (siRNA) and one negative control siRNA were designed and synthesized chemically， gastric cancer cell line SGC7901 were transfected with them mediated by three different transfection reagent. COX2 mRNA and COX2 protein of gastric cancer cell line SGC7901 were checked with real time quantitative PCR and Western blotting methods respectively.Results Transfection of gastric cancer cell line SGC7901 with report gene DNA（pcDNA/lacZ）could be mediated by TOPtranfection efficiently.Transfection rate of gastric cancer cell line SGC7901 was 56.0%， cotransfection of gastric cancer cell line SGC7901 with DNA（pcDNA/lacZ）and pcDNA/lacZsiRNA could be mediated by TOPtranfection efficiently， siRNA brought about distinguished inhibition efficiency on DNA（pcDNA/lacZ）.Compared to negative control， COX2mRNA in gastric cancer cell line SGC7901 measured by real time quantitative PCR after transfection with COX2 (0～5) siRNAs mediated by TOPtranfection were degraded significantly， COX2 siRNA resulted in highest transfection efficiency 98.3%， others were above 90%.Protein expression of COX2 in SGC7901 cell line measured by Western blotting was lower 71.5% after transfected with COX2 siRNA.Conclusion Transfection of gastric cancer cell line SGC7901 with COX2 siRNA could be mediated by TOPtranfection efficiently， RNA interference on COX2 mediated by TOPtranfection can inhibit gene and protein expression of COX2 of gastric cancer cell line SGC7901 efficiently，which may provide a new target and method for gene therapy of gastric cancer and its recurrence and metastasis.
　　【Key words】 RNA interference，cyclooxygenase2，gastric cancer，gene therapy
　　外源性或内源性双链RNA（double stranded RNA， dsRNA）在mRNA 水平上诱导细胞内同源性序列的基因表达受到抑制的现象为RNA干扰，是一种在动植物体内广泛存在的序列特异性转录后基因沉默现象（posttranscriptional gene silencing ， PTGS）［1］。2001年Elbashir 等［2］首先报道了RNAi 技术在哺乳动物细胞COS27 和HeLa 细胞中对外源报告基因荧光素酶的抑制作用，结果显示siRNA 有明显的特异性抑制作用；同时利用免疫荧光和Western blotting研究RNAi对内源LaminA 和LaminC 基因的抑制作用，显示抑制效果达90 %，从此掀开了用RNAi 技术研究哺乳动物基因功能的新篇章。因为RNAi干扰具有高度特异性、高效性、可传播性、高稳定性等特点，RNAi发展十分迅猛，目前已成为实验室调控基因表达的一种重要手段， 并已在许多研究领域中得到了应用。本实验就是应用特异、高效并且方法简单的RNAi技术，选择在胃肠道肿瘤中广泛存在、与肿瘤细胞生物学特性（肿瘤细胞的增生、凋亡、侵袭和粘附）息息相关、影响胃癌的发生和发展的COX2作为靶点，建立有效的RNA干扰方法，为胃癌及其复发和转移提供基因治疗的新方法。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料 胃癌SGC7901细胞株（上海细胞生物研究所）；大肠杆菌DH5 、XL1 blue菌株（卫生部武汉生物制品研究所）；Lipofectamin2000、1640培养基（美国Invitrogen公司）；质粒pcDNA3.1/His/lacZ质粒、TOPeasy、TOPtranfection (广州TOP公司)；Real Time RTPCR 试剂盒（Takara公司）；自动PCR仪（美国ABI公司）；Western blotting试剂盒（Cell signaling Technology 公司）。
　　1.2 实验方法和步骤
　　1.2.1 siRNA的设计和合成：根据所克隆的SGC7901细胞中COX2基因的序列，用Sfold软件设计了6条针对COX2基因的siRNA，同时设计一条阴性对照siRNA（表1），将选择的序列和相应的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行BLAST 序列比对，确信所选择的序列与其他的基因不具有同源性。通过化学方法合成以下siRNA（上海Genepharma公司）。表1 设计和合成的siRNA序列siRNA种类序列反序列Position(CDS) G/C比例COX05’CUGCUCAACACCGGAAUUUdTdT3’5’AAAUUCCGGUGUUGAGCAGdTdT3’15917747.3COX15’ACAGGAUUCUAUGGAGAAAdTdT3’5’UUUCUCCAUAGAAUCCUGUdTdT3’13915736.8COX25’UCUCUAACCUCUCCUAUUAdTdT3’5’UAAUAGGAGAGGUUAGAGAdTdT3’38340136.8COX35’ACUGAAAUUUGACCCAGAAdTdT3’5’UUCUGGGUCAAAUUUCAGUdTdT3＇1032105036.8COX45’UGAAUUUAACACCCUCUAUdTdT3’5’AUAGAGGGUGUUAAAUUCAdTdT3’1095111331.6COX55’CCGGACUAGAUGAUAUCAAdTdT3’5’UUGAUAUCAUCUAGUCCGGdTdT3’1757177563.2阴性对照5’UAGACUUACAACACACAGUdTdT3’5’ACUGUGUGUUGUAAGUCUAdTdT3’36.8
　　1.2.2 SGC7901细胞的培养：SGC7901细胞的培养使用1640培养基，FBS10%（Hyclone），在37℃，5% CO2的条件下培养，每2 d换一次液，4 d传一代，试验所使用的细胞传代次数在10代以内。
　　1.2.3 DNA、siRNA和DNA/siRNA转染SGC7901细胞转染：本研究所使用的报告基因为pcDNA3.1/His/lacZ质粒，是真核表达载体，能够在真核细胞中表达β半乳糖醛酸酶；报告基因的siRNA是lacZsiRNA。分别用Lipofectamin2000、TOPeasy和TOPtranfection介导DNA、siRNA以及DNA/siRNA的转染，方法如下：在24孔板上接种SGC7901细胞，在次日细胞密度达到70%～80%。Lipofectamin2000、TOPeasy或TOPtranfection 2.0 μl用optiMEM稀释至50 μl，在室温下放置5 min，0.8 μg的pcDNA/lacZ、siRNA或DNA/siRNA用optiMEM稀释至50 μl， 将上述稀释液混匀，在室温下放置30 min；加入培养基中，振板摇匀。24～72 h后检测基因表达情况。
　　1.2.4 荧光定量PCR COX2上游引物5’GAATCATTCACCAGGCAAATTG3’，COX2下游引物5’TCTGTACTGCGGGTGGAACA3’，COX2探针 5’FAMTGGCAGGGTTGCTGGTGGTAGGATAMRA3’。将SGC7901细胞中克隆的COX2基因克隆到pMD18 T Vector上，在大肠杆菌中扩增，提取重组的pMD18TCOX2质粒，经岛津分光光度计检测，确定含有COX2基因的重组质粒的浓度，并确定每微升DNA溶液中的拷贝数，做为标准品。使用Real Time RTPCR 试剂盒， RT反应体系为：MgCl2 2 μl、10×RT缓冲液1 μl、dNTP(各10 mM) 1 μl、RNase inhibitor 0.25 μl、AMV Reverse Transcriptase 0.5 μl、Random Primer 0.5 μl、RNA模板1 μg、补水至10 μl。RT反应条件：30 ℃ 10 min， 42 ℃ 30 min， 99 ℃ 5 min， 5 ℃ 5 min。PCR反应体系2×Real Time RTPCR Mix 12.5 μl，上述RT反应产物10 μl，补水至25 μl。PCR条件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s， 40个循环。使用自动PCR仪检测。
　　1.2.5 Western blotting 检测COX2蛋白表达：取1×107胃癌细胞加入1 ml NP40 细胞裂解液，在冰浴条件下用超声粉碎仪进行超声粉碎，转移到1.5 ml的离心管中，放置10 min， 在4 ℃ 条件下10 000 r/min，离心10 min，留取上清，5 μl上清测定浓度。用Western blot试剂盒电泳、转膜后杂交， 一抗为兔抗人COX2单克隆抗体，二抗为HRP标记的HRPantibiotin Marker（1∶1 000）。结果用凝胶图像成像及化学发光系统分析，测定信号条带的吸光度值。将已发光的膜洗脱后，重新孵育另一个抗体（兔源性GAPDH Ⅰ抗1∶500）作内参照，步骤同上。最后用目的蛋白值/内参照蛋白值的比值作为该蛋白的相对含量。
　　2 结果
　　2.1 转染方法的建立 用三种转染试剂分别以报告基因pcDNA3.1/His/lacZ转染胃癌SGC7901细胞，结果发现：TOPeasy不能够有效介导DNA（pcDNA/lacZ）转染SGC7901细胞（图1）；lipofectamin2000可以介导DNA（pcDNA/lacZ）转染SGC7901细胞，但作用微弱（图2），细胞转染率为10.2%； TOPtranfection能够有效介导DNA（pcDNA/lacZ）转染SGC7901细胞（图3），细胞转染率为56.0%；lipofectamin2000 可以介导DNA（pcDNA/lacZ）和siRNA转染SGC7901细胞，但抑制效果不明显（图4）； TOPtransfection能够有效介导DNA（pcDNA/lacZ）和siRNA共转染SCG7901细胞，并敲低lacZ基因的表达（图5）。
　　2.2 荧光定量PCR 在24孔板上接种SGC7901细胞，在次日细胞密度达到70%～80%。TOPtranfection 2.0 μl用optiMEM稀释至50 μl，在室温下放置5 min；COX2 siRNA(0～5号）及阴性对照siRNA 各0.4 μg分别用optiMEM稀释至50 μl； 将上述两种稀释液混匀，在室温下放置30 min；加入培养基中，振板摇匀。24 h后检测COX2基因表达情况，结果见表2。表2 siRNA转染后COX2 mRNA拷贝数
　　2.3 COX2蛋白表达情况 收集经COX20 siRNA及阴性对照siRNA转染的胃癌细胞1×107 ，用Western blotting 检测COX2蛋白表达（图6），用凝胶图像成像及化学发光系统分析，测定信号条带的吸光度值。结果发现，COX20 siRNA转染组COX2蛋白与内参照比值平均为0.231，阴性对照siRNA转染组COX2蛋白与内参照比值平均为0.81，COX2蛋白抑制率为71.5%。
　　3 讨论
　　恶性肿瘤是目前危害人类生命重要因素之一，人们利用RNAi干扰技术针对肿瘤发生发展的各个环节进行了多种有意义的尝试性治疗。近年RNAi发展十分迅猛，目前已成为实验室调控基因表达的一种重要手段， 并已在许多研究领域中得到了应用。尽管对RNAi 的作用机制尚不十分清楚，RNAi 是生物界普遍存在的多步骤、多因素参与的复杂的生理过程，其中小分子干扰RNA（siRNA）是RNA干扰作用赖以发生的重要中间效应分子。现有的哺乳动物siRNA制备方法主要有:①化学合成法；②DNA体外转录法；③DNA体内转录法［3，4］；④体外用RNaseIII 消化长片断双链RNA制备siRNA法；⑤体内siRNA 表达框架［5］等5种方法。本试验采用的化学合成方法尽管费用较高，但该方法是最经典、最方便，通过本实验证实，该方法也是很有效的方法。它适用于已经找到了最有效的siRNA，需要大量siRNA 进行研究的情况。
　　RNA干扰成功与否的另一关键因素是转染技术，常用方法有：①采用注射方式(显微注射、基因枪)；②用脂质体包裹；③磷酸钙共沉淀；④电穿孔法；⑤ DEAE葡聚糖或polybrene 多聚体复合物结合法；⑥利用DNA载体转染。本实验选择的TOPtranfection转染试剂是脂质体与PEI的共轭化合物，可以通过直接的物理作用打破内吞体膜，通过与Lipofectamin2000比较，TOPtranfection介导的LacZ基因的转染效率明显提高。另外，本实验发现同一种细胞对不同的转染试剂敏感程度不同，TOPtranfection和TOPeasy虽然性质相近，但TOPtranfection介导的LacZ基因的转染效率明显高于TOPeasy介导的LacZ基因的转染效率，并且，TOPtranfection介导的LacZ基因的siRNA对LacZ基因的抑制效率明显高于Lipofectamin2000和TOPeasy。
　　Yoshinouchi 等［6］向体外培养的SiHa 宫颈癌细胞内导入癌基因E6 的siRNA 后，发现SiHa 细胞的生长受到抑制，且随着E6 癌基因的受抑，E7 癌基因的量也下降；而P53 蛋白的量增高，Rb 蛋白的磷酸化程度也随之降低，表明抑癌基因也受到了激发。Wilda 等［7］在白血病细胞K562 试验中，用对MBCR/ ABL 融合基因特异的siRNA 转染K562 细胞，发现K562 细胞中相应的mRNA被清除，并出现强烈的细胞凋亡现象。Ning等［8］发现抗凋亡蛋白survivin对癌细胞有上调作用，并且可能有防止膀胱癌细胞凋亡的作用，他们通过siRNA 介导的survivin 阻滞，使得癌细胞的存活能力下降，并且转染后的膀胱癌培养细胞的凋亡率增高了60%。Takei等［9］将VEGF siRNA 加入到肿瘤细胞系和胶原Atelocollagen中，显著抑制了肿瘤细胞分泌VEGF和肿瘤血管的生成。以MDR1为靶点的RNAi克服了多药耐药性，使胰腺癌和胃癌中MDR1mRNA及蛋白水平降低超过90%，胰腺癌和胃癌对柔红霉素的耐药性分别降低了89%和58%［10］。人们利用RNAi技术改变肿瘤细胞内物质成分，在预防肿瘤浸润和转移方面取得一定效果。研究发现，受体酪氨酸激酶EphA2在多种人肿瘤中高表达，在胰腺癌中通过siRNA抑制EphA2的表达，可以有效抑制肿瘤的侵袭和生长［11］。Lakka等［12］则应用RNAi技术抑制了基质金属蛋白酶29和组织蛋白酶B的表达，从而显著抑制了肿瘤的血管生成和肿瘤细胞的侵袭和转移。

　　但是肿瘤的形成是一个多步骤、多阶段的病理过程，发病的原因复杂，在肿瘤转化过程中有更多因素参与，选择一个靶位点，通过对它的抑制起到全面抗肿瘤的效果成了一个利用RNAi干扰治疗肿瘤的突出难点。有报道显示，环氧酶2（COX2）在多种恶性肿瘤组织中高表达，在消化道肿瘤表达更高，并且认为COX2催化合成的前列腺素类产物可以促进正常和肿瘤细胞的增殖和生长［13］；COX2与肿瘤的血管生成密切相关［14］；COX2的过度表达与肿瘤侵袭淋巴管和发生淋巴结转移显著相关［15］， COX2过度表达的患者预后较差；COX2的代谢产物PGE2可抑制具有免疫调节功能的淋巴因子产生，抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖，抑制自然杀伤细胞(NK细胞)、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK细胞)及细胞毒性T淋巴细胞的活性，抑制干扰素的产生，使IL10和IL12之间的平衡失调，使机体的免疫监视能力下降［16］。因此，本试验以高转移性胃癌细胞株SGC7901为研究对象，选择对肿瘤发生发展具有广泛意义的COX2为靶点。结果显示，siRNA转染后胃癌SGC7901细胞株的COX2 mRNA抑制效率高达98.3%，COX2蛋白抑制率为71.5%。说明靶向COX2的RNA干扰治疗可能对胃癌提供多方面治疗作用，对改善胃癌预后、抑制胃癌复发和转移起到重要作用。

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