肌动蛋白和神经元特异性烯醇化酶在腺样囊性癌中表达的免疫电镜研究

　　　　 作者：张凡 常永霞 刘春秀 李瑞平

【摘要】 　　目的 研究肌动蛋白(MA)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)在腺样囊性癌（ACC）中的表达。方法 利用免疫电镜技术从超微结构水平研究MA和NSE在14例ACC中的表达。结果 MA主要表达于腺样囊性癌的细胞质中，NSE表达于ACC的细胞质和细胞核上，MA阳性细胞与NSE阳性细胞具有相似的超微结构，NSE阳性细胞的超微结构符合肌上皮细胞的超微结构特点。结论 发生神经膜细胞分化的ACC细胞是其中的肌上皮成分。

【关键词】 腺样囊性癌;神经细丝酸性蛋白;肌动蛋白;免疫电镜

　　【Abstract】 Objective To study the expressions of muscle actin (MA) and neuron specific enolase (NSE) in adenoid cystic carcinoma， and the relationship between Schwann′s cell differentiation and myoepithelial cells. Methods Ultrastructural localization of MA and NSE expression were examined by immunoelectron microscopy.Results MA was expressed in cytoplasms and NSE was expressed both in cytoplasms and nuclei. The ultrastructures of NSE positive cells were similar with those of MA positive cells. The ultrastructures of NSE positive cells accorded with the characteristics of myoepithelial cells. Conclusions Schwann′s cell differentiation occurs in myoepithelial cells of adenoid cystic carcinomas.

　　【Key words】 Adenoid cystic carcinoma; Glial fibrillary acidic protein; Muscle actin; Immunoelectron microscopy

　　腺样囊性癌(ACC)是一种常见的涎腺恶性肿瘤，极易沿神经生长并侵袭神经，其嗜神经侵袭性及其跳跃性生长使ACC的彻底治疗极为困难，因此研究ACC的嗜神经侵袭性具有重要意义。肿瘤细胞的神经膜分化可能与其侵袭神经有关，而且通过神经膜细胞标记物神经细丝酸性蛋白(GFAP)免疫组化染色，发现ACC的嗜神经侵袭可能与ACC细胞发生了神经膜细胞分化有关，但由于光镜观察的局限性，究竟ACC中是否存在神经元特异性烯醇化酶（NSE）的表达仍有待研究。务外神经侵犯可能与肿瘤细胞向神经主动运动有关，而肌动蛋白(MA)则是目前细胞胞质内标记物，与细胞存在运动功能密切相关，为了证实ACC中的神经膜细胞分化与肌上皮细胞的关系，本研究采用免疫电镜技术从超微水平观察NSE和MA在ACC中的表达，为神经侵犯的分子机制提供理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　14例ACC标本取自本院2007年1月至2007年10月颌面外科住院手术患者，男性8例，女性6例，平均年龄45.3岁；经术前活检病理证实，其中实体型5例，筛状型6例，混合行3例，神经侵犯1例；术中避开坏死区切取标本后立即固定于0.05%戊二醛与4%多聚甲醛中2 h。

　　1.2 实验步骤

　　标本固定2 h后即进行振动切片，30%蔗糖冲洗液冲洗4 h，液氮冻融，0.1 mol/L PBS缓冲液洗30 min，5%牛血清白蛋白和5%羊血清封闭1.5 h，切片加入小鼠抗人NSE多克隆抗体和小鼠抗人MA单克隆抗体后于常温下过夜(一抗均用5%牛血清白蛋白和5%羊血清配制)。第2天，0.1 mol/L PBS缓冲液洗30 min后加入二抗(IgG2胶体金复合物)，常温下放置1 d。第3天，0.1 mol/L PBS缓冲液洗30 min，2%戊二醛固定45 min，去离子水洗7次，银加强，去离子水洗7次，0.1 mol/L PBS缓冲液洗30 min，0.5%锇酸固定1 h，0.1 mol/L PBS缓冲液洗30 min，梯度脱水，于EPON812环氧树脂包埋剂中过夜。第4天，EPON812环氧树脂包埋，并于37℃、45℃及60℃下各聚合12、12、24 h。第7天，光镜下定位，超薄切片，切片厚度为70 nm，最后切片经醋酸铀和柠檬酸铅复染后，电镜下观察。每例标本各取2张切片分别采用0.1 mol/L PBS缓冲液代替一抗作空白对照。

　　1.3 试剂和仪器

　　NSE多克隆抗体(DAKO，丹麦，工作浓度1∶50)、小鼠抗人MA单克隆抗体(DAKO，丹麦，工作浓度1∶50)，日本电子JEM2100型电子显微镜。

　　2 结 果

　　2.1 光镜观察

　　光镜下半薄切片观察肿瘤细胞，可见大小不等的细胞巢或实心团块，部分标本上皮细胞巢内有许多圆形腔隙，形成筛孔状结构，有的肿瘤细胞形成实心团块和筛状两种结构；MA阳性细胞和NSE阳性细胞均散在分布于肿瘤细胞巢中或环形分布于筛孔状结构的周边，其中神经侵犯的肿瘤细胞呈现MA和NSE的强阳性表达。

　　2.2 电镜观察

　　肿瘤主要由2种形态不同的细胞组成，一类为立方状细胞，细胞轮廓比较规则，胞核呈圆形和卵圆形，这类细胞NSE和MA抗体均为阴性（图1）。另一类细胞形态多样，有的呈多角形，有的呈梭形，多数均可见细长的胞质突起，这类细胞多数能被抗MA抗体和抗NSE抗体所标记，MA阳性细胞的胶体金颗粒主要位于细胞质中，它们多数具有梭形的细胞核以及细长的胞质突起（图1）。NSE阳性细胞的胶体金颗粒同时位于细胞核与细胞质内（图1）。这类细胞的共同特征为细胞核形态不规则，多数呈梭形，与细胞质突起的长轴平行，胞质内可观察到平行的肌微丝结构(图1)。

　　3 讨 论

　　ACC是颌面外科常见的一种恶性肿瘤，尽管肿瘤细胞大多呈现高分化，却极易侵袭神经，呈跳跃式转移，临床上常有面瘫，感觉障碍等神经受损症状，给临床治疗带来很大困难。因此研究该肿瘤神经侵犯和转移机制意义重大。

　　NSE可从正常人脑中分离获得，在星形神经胶质细胞及其肿瘤中存在，还见于各类型的星形细胞、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、神经鞘瘤以及一些具有神经内分泌功能的肿瘤中，并被用作神经膜细胞的特异性标记物之一。ACC主要有两种细胞来源导管内衬上皮细胞和肌上皮细胞。究竟是ACC中哪种成分发生了神经膜细胞分化，目前并不清楚。其中肌上皮细胞是一种兼具上皮和间叶组织结构和功能表型的细胞，它属上皮来源，但结构与平滑肌类似，含有MA，具有收缩功能，肌上皮细胞还含有微管结构，具有与神经轴突某些相似的结构特点，能参与神经冲动的传导，但目前并无肌上皮细胞出现神经细胞样分化的报道。Toth等〔1，2〕曾通过光镜对比观察ACC和多形性低度恶性腺癌，认为ACC中某些肿瘤细胞和多形性低度恶性腺癌中变异的肌上皮细胞形态上与神经膜细胞相似，提出这些细胞在肿瘤发生演变过程中发生了神经膜细胞分化，但他既没有进行肌上皮细胞的特异性染色，也没有通过超微结构辨认，这样的结论显然是没有说服力的。我们研究显示所有14例标本均呈现NSE阳性表达，而且在神经侵犯病例中出现高表达。因此我们证实肿瘤中有部分细胞出现了神经分化，在筛状的周边尤为明显。

　　MA是目前最常用的肌上皮细胞标记物，本实验发现在ACC中，神经膜细胞标记物NSE阳性细胞与MA阳性细胞具有相似的超微结构，这种超微结构符合Redman归纳的肌上皮细胞的超微结构特点，即具有细长的细胞突起、梭形的细胞核、细胞核与细胞的长轴或最长的细胞突起平行、胞质内平行排列的微丝〔3～5〕。因此我们推测ACC中发生神经膜细胞分化的应该是其中的肌上皮细胞成分。而这些肿瘤性肌上皮细胞发生神经膜细胞分化，表现出神经膜细胞的某些特性，进而可以直接与神经膜细胞表面受体识别结合，使ACC具有了嗜神经侵袭的能力，同时肿瘤细胞仍保留肌上皮的运动特性，因此肿瘤细胞与神经膜细胞黏附后会一直沿神经束迁移，这可能是ACC嗜神经侵袭的组织学基础。
　　
　　ACC的神经侵犯特性可能与其他肿瘤在间质中的浸润转移有相似之处，细胞间的黏附状态会随肿瘤发展的不同阶段发生变化。最新研究显示：ACC中肌上皮细胞的神经分化可能表达多种神经细胞表面的多种受体〔6，7〕，但受体的表达水平肯定随神经侵犯过程不断发生变化，需要今后更加深入研究证实。

参考文献

　　1 Balica N，Raica M，Cotulbea S.Mast cell reaction in malignant laryngeal neoplasm〔J〕.Rom J Morphol Embryol，2007;48(4):395401.

　　2 Seethala RR，Hunt JL，Baloch ZW，et al.Adenoid cystic carcinoma with highgrade transformation：a report of 11 cases and a review of the literature〔J〕.Am J Surg Pathol，2004;31(11):168394.

　　3 Yoshimura T，Sumida T，Liu S.Growth inhibition of human salivary gland tumor cells by introduction of progesterone receptor and Pg treatment〔J〕. Endocr Relat Cancer，2007;14(4):110716.

　　4 Moore MG，Deschler DG，McKenna MJ.Management outcomes following lateral temporal bone resection for ear and temporal bone malignancies〔J〕. Otolaryngol Head Neck Surg，2007;137(6):8938.

　　5 Zhang B，Guan CC，Chen WT.A20 inhibits human salivary adenoid cystic carcinoma cells invasion via blocking nuclear factorkappaB activation〔J〕. Chin Med J (Engl)，2006；120(20):18305.

　　6 Shang J，Sheng L，Wang K.Expression of neural cell adhesion molecule in salivary adenoid cystic carcinoma and its correlation with perineural invasion〔J〕.Oncol Rep，2005；18(6):14136.

　　7 Yokouchi H，Otsuka Y，Otoguro Y.Primary peripheral adenoid cystic carcinoma of the lung and literature comparison of features〔J〕.Intern Med，2007;46(21):1799803.