多药耐药相关蛋白3表达与肝癌耐药的相关性

　　　　　　 作者：郭晓林 姜雅秋 金清龙

【摘要】 　　目的 探讨多药耐药相关蛋白3（MRP3）的表达与肝癌耐药的相关性。方法 应用RTPCR方法检测正常肝细胞L02、肝癌细胞BEL及肝癌耐药细胞HepG2/ADM中MRP3 mRNA的差异表达，再将MRP3反义及正义寡核苷酸片段分别用脂质体转染进肝癌耐药细胞HepG2/ADM中，用MTT法、流式细胞仪及RTPCR检测转染后细胞内阿霉素（ADM）的荧光强度、耐药指数及MRP3 mRNA的表达情况。结果 肝癌耐药细胞HepG2/ADM中MRP3 mRNA的表达明显高于正常肝细胞L02和肝癌细胞BEL（P<0.05）。MRP3反义转染进耐药细胞后，可明显降低细胞内ADM的耐药指数，提高细胞内ADM浓度（P<0.05），细胞内MRP3 mRNA的表达较未转染细胞下降了62.5%（P<0.05）。结论 MRP3的高表达可能是导致肝癌多药耐药的机制之一。

【关键词】 肝癌；多药耐药；多药耐药相关蛋白3

　　【Abstract】 Objective To explore the relationship between the expression of multidrug resistance relative protein3 (MRP3) and liver cancer multidrug resistance. Methods The expression of MRP3 in normal hepatocyte L02， hepatocarcinoma cell BEL and hepatocarcinoma multidrug resistance cell line HepG2/ADM were detected by RTPCR. Anti and oligonucleotide of MRP3 were transfected by lipidosome into HepG2/ADM， intracellular doxorubicin (ADM) fluorescence intensity， resistance index， and the expression of MRP3 mRNA were detected by MTT， flow cytometry， and RTPCR. Results The expression of MRP3 in HepG2/ADM was higher than that of normal hepatocyte L02 and hepatocarcinoma cell BEL. After transfected with antioligonucleotide MRP3， ADM fluorescence intensity， resistance index， and the expression of MRP3 mRNA were all obviously decreased (P＜0.05). Conclusions Higher expression of MRP3 maybe one of the mechanisms of hepatocarcinoma multidrug resistance.

　　【Key words】 Hepatocarcinoma; Multidrug resistance; Multidrug resistance relative protein3

　　肿瘤细胞多药耐药产生的分子机制非常复杂，在所有耐药机制中，被认为是最主要的也是人们研究最多就是ABC结合核膜转运蛋白，如P糖蛋白（Pgp）、多药耐药相关蛋白1(MRP1)及乳腺癌耐药蛋白；而最近又发现几个多药耐药相关蛋白的新成员多药耐药相关蛋白2(MRP2)、MRP3、MRP5 〔1～4〕，为探讨MRP3与肝癌耐药的相关性，我们从分子水平研究MRP3在肝癌耐药细胞株HepG2/ADM与肝癌细胞株和正常肝细胞株中的差异表达情况，为肝癌的多药耐药提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞株及来源

　　人肝脏细胞系L02和肝癌细胞系BEL购自中国科学院上海细胞生物学研究所。人肝癌耐药细胞HepG2/ADM购于广州市达晖生物技术有限公司。

　　1.2 主要试剂、材料与仪器

　　阿霉素标准品、MTT均购自Sigma公司，RNA提取试剂盒、Trizol试剂及逆转录酶MMLV均为为Invitrogen产品；DNA聚合酶为大连宝生物工程有限公司产品；显色试剂盒ECL Western印迹试剂为Amersham产品。Microplate Reader450酶标仪；GeneAmp PCR System 2400 型PCR 扩增仪；EPICS 型流式细胞仪；AlphaEaseFC凝胶成像系统。

　　1.3 RTPCR法检测MRP3 mRNA的表达

　　采用Trizol一步法提取细胞总RNA，MMLV逆转录酶进行逆转录及PCR扩增，合成cDNA。以βactin 作为内参照。PCR引物序列为MRP3 (107 bp)：上游5′CTTAAGACTTCCCCTCAACATGC3′，下游5′GGTCAAGTTCCTCTTGGCTCA3′；βactin ( 214 bp )：上游5′GTGGGGCGC CCCAGACACCA3′，下游5′CTCCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′；扩增条件为：94℃预变性5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，25个循环，72℃延伸7 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，在多向分析凝胶成像系统中观察。

　　1.4 MRP3寡核苷酸的转染

　　参照脂质体说明书进行转染。HepG2/ADM细胞消化后计数，分别接种于6孔细胞贴壁，更换无血清培养基。实验分反义组、正义组、空脂质体组及对照组。每组设3个复孔，实验重复3次。具体步骤按说明书操作。全硫代磷酸修饰的正、反义寡核苷酸(22 bp)：MRP3正义链：5′GATCCGAGTAAGACCATTCAGGTCTTCAAGAGAGAGACCTGAAT
GGTCTTACTCTTTTTTA3′；反义链：5′AGCTTAAAAAAGAGTAAGACCATTCAGGTCTCTCTTGAAGACCTGAATGGTCTTACTCG3′。

　　1.5 胞内ADM浓度的测定

　　取转染前及转染24 h后HepG2/ADM细胞，胰酶消化，调整细胞密度为5×105/ml，细胞贴壁后加入ADM 1 μmol/L，37℃作用30 min，冷PBS洗1次，更换无药培养基继续培养30 min后收获细胞，采用FCM检测胞内ADM的荧光强度。

　　1.6 转染后MRP3 mRNA的表达

　　半定量RTPCR法测定。收集6孔板中转染24 h的各组细胞，行PCR扩增，PCR产物经电泳后在多向分析凝胶成像系统中扫描并分析、计算MRP3基因的相对表达值。实验重复3次。

　　1.7 转染前后细胞内ADM耐药指数

　　细胞转染24 h后，在96孔板中分别加入6个不同浓度的ADM，设5个复孔，对照组加生理盐水，继续培养48 h，吸出培养基，每孔加入5 mg/ml MTT 10 μl，37℃ 4 h。每孔加入200 μl二甲亚砜，避光振荡混匀，全自动酶标仪测定620 nm波长的吸光度值(A)，细胞相对存活率=(实验组A/对照组A)×100%，作图得IC50，计算耐药指数(RI)，RI=耐药细胞IC50/亲代细胞IC50。

　　2 结 果

　　2.1 MRP3 mRNA在各细胞系中的表达

　　MRP3 mRNA在L02中表达量为 4 620±362，在BEL中表达量为7 871±386，此两组MRP3mRNA表达量明显低于HepG2/ADM中的表达量（9 802±373）（P均<0.05）。

　　2.2 HepG2/ADM细胞内ADM荧光强度检测

　　转染前HepG2/ADM细胞内ADM的荧光强度为6.94±0.57，单纯转染空脂质体及正义链后，其内ADM的荧光强度分别为6.25±0.55和6.59±0.45，较转染前无明显改变（P>0.05）。转染反义链后，其内ADM的荧光强度分别为9.68±0.58，较转染前明显增加（P<0.05）。

　　2.3 转染前后HepG2/ADM细胞ADM耐药指数

　　转染前HepG2/ADM细胞的ADM耐药指数为18.56，转染空脂质体和正义链的HepG2/ADM细胞的ADM耐药指数分别为17.78和16.89，与转染前的耐药指数无明显差异，而转染反义链的HepG2/ADM细胞ADM耐药指数为5.56，较转染前明显下降（P<0.05）。

　　2.4 转染前后HepG2/ADM细胞MRP3 mRNA的表达

　　单纯转染空脂质体及正义链的HepG2/ADM细胞MRP3 mRNA的表达分别为89.67±4.28和85.34±4.56，与转染前（86.87±4.67）无明显降低，而转染反义链后，HepG2/ADM细胞MRP3 mRNA的表达（32.58±3.75）较转染前明显降低了62.5%（P<0.05）。

　　3 讨 论

　　肿瘤耐药的本质是肿瘤细胞在生存压力下建立起来的一种适应过程，其产生和维持有其复杂的分子网络。因此，从基因表达水平寻找在耐药产生中具有关键作用的分子改变，对于全面了解耐药机制从而逆转耐药具有重要的意义。MRP3是多药耐药蛋白家族的成员之一，属ATP膜转运蛋白，在氨基酸序列上与MRP1有58%同源性，编码分子量为190 kD的糖蛋白，在肝、十二指肠、结肠、肾上腺及胰腺中呈高表达。作为胞浆膜流出泵，在VP16的流出、活性及敏感性方面起关键作用，参与了VP16、MTX、DDP、DOX的耐药，而反义MRP3 cDNA 能改变VP16、DDP等药物的敏感性〔5～7〕。
　　
　　本研究采用RTPCR方法检测了正常肝细胞，肝癌细胞及肝癌耐药细胞中MRP3的表达情况，结果表明肝癌耐药细胞中的MRP3 mRNA的表达量明显高于正常肝细胞和肝癌细胞。故此我们推测MRP3可能参与了肝癌的耐药，这与Leah等〔8〕报道的MRP3参与非小细胞肺癌的耐药机制具有一定的相似性。
　　
　　反义治疗是基因治疗的重要组成部分，其阻断作用主要在翻译过程，而翻译起始位点附近的核苷酸常常是决定翻译的关键因子，因此与mRNA起始编码区的结合可能起最有效的阻断作用。根据这一原则及MRP3 cDNA序列，设计并人工合成了包含MRP3 mRNA翻译起始位点ATG的寡脱氧核苷酸，通过阳离子脂质体载体，将MRP3片段转染进高表达MRP3的HepG2/ADM细胞后，MRP3 mRNA表达显著下降，胞内药物浓度显著上升，对阿霉素的敏感性得到恢复；而转染正义寡核苷酸或脂质体的耐药株上述指标无显著变化。进一步证实肝癌细胞株的耐药主要是由于MRP3的过表达导致胞内药物浓度降低所产生；而MRP3的反义寡核苷酸可抑制其表达。

　　本研究结果表明，肝癌耐药细胞株中MRP3的表达明显增加，而用反义链MRP3 cDNA可使表达MRP3的细胞株恢复对阿霉素的敏感性，所以MRP3的表达对肝癌细胞的化疗药物耐药有着极大的关系，且针对MRP3基因表达的干扰能有效地逆转肝癌细胞的多药耐药，增强了肝癌细胞对化疗药物的敏感性，这在肿瘤的基因治疗方面也显示了可观前景。

参考文献

　　1 Han Y，Sugiyama YC.Expression and regulation of breast cancer resistance protein and multidrug resistance associated protein 2 in BALB/c mice〔J〕.Biol Pharm Bull，2006;29(5)：10325.

　　2 Daniel S，Susann W，Gunnar C，et al.The multidrug resistance associated protein3 (MRP3) is associated with a poor outcome in childhood ALL and may account for the worse prognosis in male patients and Tcell immunophenotype 〔J〕.Blood，2003;102(13)：44937.

　　3 Susan P，Robert L，Shepard ST，et al.The multidrug resistance protein 5 (ABCC5) confers resistance to 5fluorouracil and transports its monophosphorylated metabolites〔J〕.Mol Cancer Ther，2005;4(5)：85563.

　　4 Makoto Y，Toshihiro S，Takefumi K，et al.Induction of MRP5 and SMRY mRNA by adriamycin exposure and its overexpression in human lung cancer cells resistance to adriamycin〔J〕.Int J Cancer，2001;94(4)：4327.

　　5 Kruh GY，Belinsky MG.The MRP family of drug efflux pumps〔J〕. Oncogene，2003;22(47)：753752.

　　6 Zhang CY，Feng YX，L i P，et al.Study on the relationship between the resistance to MTX and the transport protein superfamily of ATPbinding cassette that induces multiple drug resistance〔J〕.Yi Chuan，2006;28(10)：12015.

　　7 Huang R，Murry DJ，Kolwanker D，et al.Vincristine transcriptional regulation of efflux drug transporters in carcinoma cell lines〔J〕.Biochem Pharmacol，2006;71（2）：1695704.

　　8 Leah CY，Barbara GC，Susan PC，et al.Multidrug resistance proteins MRP3，MRP1 and MRP2 in lung cancer：correlation of protein levels with drug resistance and messenger RNA levels〔J〕.Clin Cancer Res，2001；7（6):1798804.