天麻钩藤饮对帕金森病大鼠神经行为学及氧化应激反应的影响

　　　　　　作者：王文武 何建成 丁宏娟

【摘要】 　　目的 观察天麻钩藤饮对帕金森病(PD)大鼠神经行为学及氧化应激的影响。方法 采用6羟基多巴胺(6OHDA)注射于脑右侧黑质造成单侧PD损毁模型，并用中药天麻钩藤饮（浓度为5.13 g/ml）进行治疗，共给药14 d。同时设立正常对照组、假手术组，观察各组大鼠神经行为学的变化，同时运用化学比色法测定大鼠中脑黑质、纹状体部位活性氧、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的活性。结果 神经行为学方面，模型组大鼠治疗前后旋转圈数无显著差异；天麻钩藤饮组大鼠旋转圈数较模型组显著减少（P＜0.05），且治疗前后比较差异显著（P＜0.05）；模型组活性氧、MDA明显升高，GSH、GSHPx、SOD明显降低，与正常对照组、假手术组比较，差异显著（P＜0.05或P＜0.01）；而天麻钩藤饮对其均有明显的改善作用（P＜0.05）。结论 天麻钩藤饮可以明显改善PD大鼠的神经行为学变化，并可以提高机体的抗氧化和清除自由基的能力。

【关键词】 天麻钩藤饮；帕金森病；神经行为学；氧化应激；大鼠

　　【Abstract】 Objective To observe effect of tianma gouteng drink on the behavioural and oxidation stress response of Parkinson’s disease (PD) rat.Methods Rats were pided into normal control， sham operation， model， and treatment groups (6 rats in each group). PD rats were produced by injection of 6OHDA stereotaxically into the right side of the mesencephic ventral tegmental area (VTA ) and substantia nigra pars compacta (SNc) and treated with tianma gouteng drink (5.13 g/ml) for 14 days. Behavioural changes and the activity of reactive oxygen species (ROS)， glutathione (GSH)， glutathione peroxidase (GSHPx)， superoxidase dismutase (SOD)， malonaldehyde (MDA) of the substantia nigra and corpus striatum of the PD rats were observed. Results There was no significant difference in rotation behaviour between before and after treatment in model group (P＞0.05). Compared to model group， the rotation behaviour was significantly decreased in treatment group， and there was significant difference between before and after treatment in treatment group (P＜0.05). Compared with the normal control and sham operation groups， ROS and MDA contents were obviously increased and GSH， GSHPx and SOD contents were obviously reduced in model group (P＜0.05). However， the above indicators were improved in treatment group (P＜0.05). Conclusions Tianma gouteng drink can significantly improve the neurological behavior， and enhance antioxidation ability and eliminate free radicals of PD rats.

　　【Key words】 Tianma gouteng drink；Parkinson’s disease；Neurological behavior； Oxidation stress；Rat

　　帕金森病(PD)是以静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势异常为主要临床特征的慢性神经系统变性疾病。随着人口老龄化的日趋明显，本病的发病率有上升趋势。已有研究表明，氧化应激反应和自由基损害在PD等神经变性疾病中起重要作用〔1，2〕，PD患者机体处于氧化应激状态〔3〕。因此，通过提高机体的抗氧化能力和清除自由基的能力来治疗PD日益受到大家的重视。研究发现，中医药不仅对本病具有较好的疗效，而且与西药合用可以提高临床疗效，同时可降低化学合成药物的副作用〔4〕。本研究所用的天麻钩藤饮是临床治疗PD的常用方剂，本实验观察了天麻钩藤饮对PD大鼠神经行为学及氧化应激反应的影响，旨在从氧化应激方面揭示天麻钩藤饮治疗PD的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物

　　SD大鼠，45只，SPF级，雄性，体重180～200 g(3月龄)，由上海中医药大学实验动物中心提供。许可证号：SYXK（沪）20040005。

　　1.1.2 药品、试剂和仪器

　　药品：盐酸氯胺酮（上海中西药业股份有限公司产品，批号：000602，0.05 g/ml）；庆大霉素(上海第一制药厂产品，批号：001250，0.3 g/支）；天麻钩藤饮（天麻9 g，钩藤12 g，石决明18 g，山栀9 g，黄芩9 g，川牛膝12 g，杜仲9 g，桑寄生9 g，夜交藤9 g，砂茯神9 g，益母草9 g，浓度为5.13 g/ml），按既定工艺煎煮成汤药，由上海雷允上药材有限公司代加工。试剂：6羟基多巴胺（6OHDA）为美国Sigma公司；阿扑吗啡（APO）为美国Sigma公司产品；抗坏血酸为美国Sigma公司产品；活性氧、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。仪器：TOW3A型大鼠脑立体定位仪为广东汕头市教育医学仪器厂产品；微量进样器（5 μl）为上海第三分析仪器厂生产；离心机为上海中科DL50RC型；XW80A旋涡混合器为上海医科大学仪器厂制造；电热恒温水温箱（HH·W21·600）为上海跃进医疗器械厂生产；721型分光光度计为上海第三分析仪器厂制造。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型制备〔5〕

　　术前按常规进行行为学测试，确认无异常旋转行为后，用盐酸氯胺酮（80 mg/kg）腹腔注射麻醉。然后将大鼠固定于脑立体定位仪上，头部去毛，苯扎溴铵(商品名：新洁尔灭)常规消毒。无菌条件下，沿正中线切开大鼠颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前囟。以前囟为准，根据包新民〔6〕等著大鼠脑立体定位图谱，确定右侧黑质二坐标：①前囟后5.2 mm，正中线右侧1.0 mm，硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm，正中线右侧2.5 mm，硬膜下8.5 mm。用颅骨钻于手术要求部位小心钻开颅骨，用5 μl微量进样器将6OHDA(溶于含维生素C的生理盐水中)注入右侧黑质部(以1.0 mm/min速度缓慢进针)，每孔3 μl，注射速度为1 μl/min，注射完毕后留针5 min，然后以1.0 mm/min速度缓慢退针。手术完成后，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口皮肤，肌肉注射庆大霉素7 d，待动物清醒后放回饲养笼中饲养。假手术组只注射含维生素C的等量生理盐水，其余条件与造模手术相同。正常对照组只固定大鼠，不进行任何处理。造模手术10 d以后，腹腔注射APO（0.5 mg/kg）诱发大鼠向健侧旋转，记录开始旋转至30 min内的旋转圈数，以旋转圈数平均每分钟超过7次者为合格的PD模型〔7〕。

　　1.2.2 分组干预

　　将造模成功的12只大鼠按旋转圈数随机分为2组，分别为PD模型组、天麻钩藤饮组；其他纳入正常对照组、假手术组，共计4组，每组6只。对PD模型组、假手术组和正常对照组用生理盐水灌胃（2 ml/只），天麻钩藤饮组灌胃天麻钩藤饮（5.13 g/ml，2 ml/只），各组动物正常摄食、饮水，共14 d。

　　1.2.3 神经行为学检测

　　实验结束后，以腹腔注射APO（0.5 mg/kg）诱发大鼠向健侧旋转，观察并记录开始旋转至30 min内的旋转圈数。旋转行为即以左侧后肢为支点原地旋转，头尾相接，身体成环状。

　　1.2.4 氧化应激指标检测

　　大鼠行为学测试完毕后，立即断头取脑，小心分离黑质，制备脑组织匀浆液。按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书步骤进行氧自由基检测。

　　1.3 统计学处理

　　所有资料均用x±s表示，采用SPSS13.0版软件进行齐性检验并做t检验、方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠旋转圈数比较

　　正常对照组、假手术组大鼠未见旋转行为。模型组、天麻钩藤饮组大鼠注射APO后0.5～5 min时，均出现旋转行为。模型组治疗前旋转圈数为(252.67±33.91)，治疗后为(254.78±38.27)，两者差异无显著性（P＞0.05）；天麻钩藤饮组治疗前旋转圈数为(250.30±26.76)，治疗后为(222.00±34.98)，治疗前后差异显著（P＜0.05），与模型组比较，天麻钩藤饮组的旋转圈数亦明显减少（P＜0.05）。

　　2.2 各组大鼠氧化应激反应比较

　　模型组活性氧、MDA明显升高，与正常对照组、假手术组差异显著（P＜0.05或P＜0.01），GSH、GSHPx、SOD明显降低，与正常对照组、假手术组比较差异显著（P＜0.01）。天麻钩藤饮组与模型组比较，活性氧、GSH、GSHPx、SOD、MDA差异显著（P＜0.05），见表1。表1 各组大鼠氧化应激反应的变化(略)

　　3 讨 论

　　在PD大鼠的行为学评价上，各方面研究试图找到更客观的指标〔8〕，但迄今APO诱发旋转试验依然〔9〕是目前主要的评价指标。APO是一种D2受体激动剂，存在于多巴胺能神经元的突触后膜。当PD动物模型的毁损侧多巴胺能神经元减少时，在受体调节机制下，同侧D2受体出现上调，受体密度增加，敏感性增强，出现去神经超敏感现象，故当用APO激动D2受体时，产生了比健侧更强的DA活性，因而表现为向健侧的旋转。本研究结果发现，模型组大鼠治疗前后旋转圈数比较，差异无显著性意义，表明模型稳定、可靠，而天麻钩藤饮组大鼠旋转圈数较模型组显著减少，且治疗后旋转圈数较治疗前亦显著减少，说明天麻钩藤饮对PD大鼠的旋转行为有很好的改善作用。

　　已有足够的证据表明，氧化应激反应和自由基损害在PD等神经变性疾病中起重要作用〔1，2〕，而PD病人机体处于氧化应激状态〔3〕，PD病人中脑黑质内存在铁离子浓度升高、线粒体功能下降、抗氧化保护系统如SOD、GSH等功能异常，导致氧化应激反应增强，氧自由基产生过多，引起蛋白质、脂质过氧化损害和断裂，导致神经元发生凋亡。本研究提示PD大鼠的氧化反应被激活，处于氧化应激状态，与文献报道一致〔10〕。6OHDA具有与其他儿茶酚胺类物质相似的结构，可与高亲和力的儿茶酚胺转运系统结合进入黑质、纹状体多巴胺能神经元相应的神经元内，在MAOB作用下产生h3O2，再由h3O2在金属铁、铜的转换作用下生成OH，直接引起氧化应激反应。GSHPx可特异催化GSH对h3O2的还原反应，对细胞结构和功能的完整具有重要的保护作用，GSHPx活力的高低直接反映了机体清除自由基的能力〔11〕。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要作用，它能清除超氧阴离子和自由基而保护细胞免受损伤，其活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力〔12，13〕。但SOD对氧自由基的清除能力总是有限的，如果氧自由基的产生超过清除能力，氧自由基就会对机体造成危害。机体产生的氧自由基能攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化物，如MDA、羟基、羰基等而引起细胞死亡，故MDA可反映体内脂质过氧化的程度，从而间接反映细胞受自由基攻击的严重程度。与模型组相比，天麻钩藤饮组活性氧、MDA明显降低，GSH、GSHPx、SOD明显升高。提示天麻钩藤饮可以提高机体的抗氧化能力和清除自由基的能力。

　　天麻钩藤饮出自胡光慈所著《杂病证治新义》，具有平肝熄风、清热安神、补益肝肾之功效，主治肝阳上亢、肝风内动之证。已有的研究表明，PD病机以肝肾阴虚，虚风内动为主〔14〕。现代中药药理研究表明，天麻钩藤饮可提高高血压病患者血浆SOD活性，降低MDA含量〔15〕，天麻可明显提高SOD的活性，降低MDA含量〔16〕，所以我们认为天麻钩藤饮可能是通过局部治疗和整体调节作用，达到了对PD患者自由基的清除作用，从而使机体免受自由基的损害。

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