小檫碱对高脂兔模型脂代谢及脂肪PPARγ、INSIG2基因表达的影响

　　　　　　 作者：何琦 金磊 周岐新 杨俊霞

【摘要】 　　目的 研究小檗碱对高脂兔模型脂代谢的影响，及其与脂肪代谢相关基因表达变化的相关性。方法 采用高脂饲料喂养建立家兔高脂模型，测定各处理组血清TC、TG、LDLC和HDLC水平。实时荧光定量PCR技术检测脂肪组织PPARγ和INSIG2基因表达。 结果 高脂组TC、TG和LDLC水平较普食组明显升高（P<0.05），而小檗碱处理后血清TC、TG和LDLC的水平较高脂组明显降低（P<0.05）；实时荧光定量PCR检测结果显示，高脂组PPARγ和INSIG2 mRNA表达明显高于普食组（P<0.05），小檗碱处理后PPARγ mRNA表达明显较高脂组显著降低（P<0.05），而INSIG2 mRNA表达则较高脂组明显上调（P<0.05），且低剂量作用更明显。 结论 小檗碱具有明显的降血脂作用，其机制与PPARγ表达下调而INSIG2基因表达上调有关。

【关键词】 小檗碱；高血脂；PPARγ；INSIG2

　　【Abstract】Objective To investigate the effects of berberine on lipids metabolism of hyperlipidemic rabbits， and to explore whether its mechanism was involved in the regulation of PPARγ and INSIG2 gene expressions in adipose tissue. Methods The rabbit hyperlipidemic model was established by feeding with high fat diet. The levels of serum total cholesterol (TC)， triglycerides (TG)， low density lipoproteincholesterol (LDLC) and high density lipoproteincholesterol (HDLC) in each different treated group were determined. The mRNA expressions of PPARγand INSIG2 in adipose tissue were quantified by real time quantitative PCR. Results The levels of serum TC， TG and LDLC in high fat diet group obviously were elevated compared with those in normal diet group (P＜0.05). Compared with those of the high fat diet group， the serum levels of TC， TG and LDLC in berberine treated group were significantly decreased (P＜0.05). The result of real time PCR demonstrated that the mRNA expressions of PPARγand INSIG2 in high fat diet group were significantly higher than those of the normal diet group (P＜0.05)， while the PPARγmRNA expression was inhibited and the INSIG2 mRNA expression was upregulated by berberine (P＜0.05). Conclusions Berberine can obviously decrease the blood lipid levels in the hyperlipidemic rabbits and its mechanisms may be related to the downregulation of the PPAγmRNA expression and upregulation of the INSIG2 mRNA expressions.

　　【Key words】Berberine; Hyperlipidemia; PPARγ; INSIG2

　　黄连素学名小檗碱，有广泛的药理作用，在治疗阿尔茨海默病(AD)、抗肿瘤、降血糖、调血脂等方面都有显著的作用。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)的一种亚型PPARγ，可控制脂肪的储存和释放，并维持机体能量平衡，调节胰岛素以及血糖的稳定，促进脂肪细胞基因的表达，在脂肪细胞分化的早期起正向调节作用〔1～3〕。胰岛素诱导基因2(insulin induced gene 2，INSIG2)是近年来发现的与脂质代谢和脂肪细胞分化密切相关的基因，其编码的INSIG2内质网膜蛋白，通过与胆固醇（TC）调节元件结合蛋白（sterol regulatory elementbinding protein，SREBP）及SREBP裂解活化蛋白（SREBP cleavage activating protein，SCAP）相结合，从而影响SREBP活化而阻断TC和脂肪酸的合成，在维持体内TC代谢稳定方面具有十分重要的作用〔4，5〕。因此，PPARγ与INSIG2均与体内脂质代谢紊乱的发生和发展存在着密切的相关性。本实验以饮食诱导的兔高脂模型为研究对象，旨在探讨小檗碱调节血脂的作用，并进一步探讨其作用机制是否与PPARγ、INSIG2基因表达相关。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物和试剂

　　清洁级雄性新西兰大耳白兔，40只，体重2.0～2.2 kg，由重庆医科大学实验动物中心提供（医学动物合格证：SCXK 渝20070003）。小檗碱购于四川鸿鸣植物制品有限公司，纯度≥97%，批号080626；非诺贝特购于河南开封制药有限公司，纯度≥98%，批号080527；RNA提取试剂RNAiso Plus与实时荧光定量PCR试剂盒购于TaKaRa公司；PCR引物由上海生工设计并合成。

　　1.2 动物分组以及模型制作〔6〕

　　40只白兔单笼饲养，自由摄食及饮水。以基础饲料适应性喂养1 w后，随机选取8只为普通饲料组（ND），以基础饲料喂养。其余32只以高脂饲料喂养（饲料组成：每10 kg基础饲料加150 g TC、500 g猪油、1 kg鸡蛋），并随机分为高脂饲料组（HFD）；高脂饲料+阳性对照药非诺贝特组（FD）：高脂饲料基础上按30 mg·kg-1·d-1灌胃给予非诺贝特；高脂饲料+小檗碱低剂量组（BLD）：高脂饲料基础上按28 mg·kg-1·d-1灌胃给予小檗碱；高脂饲料+小檗碱高剂量组（BHD）：高脂饲料基础上按112 mg·kg-1·d-1灌胃给予小檗碱。每周称体重，实验期为16 w。

　　1.3 血脂的测定

　　分别于实验前和实验末禁食12 h后兔耳缘静脉采血，离心分离血清，采用全自动生化分析仪检测血清TC、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）水平。

　　1.4 实时荧光定量PCR法检测脂肪组织PPARγ和INSIG2基因表达

　　取兔肾周脂肪组织，在液氮下研磨，按RNAiso Plus试剂说明书提取总RNA，紫外分光光度计定量并计算A260/A280比值，琼脂糖凝胶电泳检测确保RNA的完整性。反转录体系：5×PrimeScriptTMBuffer 2 μl，PrimeScriptTM RT Enzyme MixⅠ0.5 μl，Oligo dT Primer 0.5 μl，Random 6 mers 0.5 μl，Total RNA 2 μl(300 ng)，RNase Free dh3O补足至10 μl，混匀。反转录条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s终止反应。PPARγ基因上游引物：5′AGGACATCCAGGACAACC3′，下游引物：5′GTCTCCGTCTTCTTTATCAC3′；INSIG2基因上游引物：5′TGGACTGTGGTGGACTTT3′；下游引物：5′TGTTTCCCATTGTTATGC3′；内参βactin基因上游引物：5′CGAGATCGTGCGGGACAT3′，下游引物：5′AGGAAGGAGGGCTGGAACA3′。PCR反应体系（25 μl）：SYBR Rremix Ex TaqTM Ⅱ12.5 μl，上下游引物（浓度10 μmol/L）各1 μl，cDNA 2 μl，灭菌蒸馏水8.5 μl，混匀。反应条件均为：95℃，预变性5 s；95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，循环40次。反应结束后自动生成溶解曲线，结果以Ct值表示。以公式F=2-△△Ct来计算各处理组和普食组之间目的基因的相对表达量。

　　1.5 统计学处理

　　实验数据用x±s表示，采用SPSS13.0统计分析软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析（OneWay ANOVA）。

　　2 结 果

　　2.1 小檗碱对高脂兔血脂的影响

　　实验前各组家兔的血脂水平(TC、TG、LDLC和HDLC)相近，无显著性差异。经16 w营养干预后，HFD组、FD组、BLD组、BHD组与ND组相比，TC、TG和LDLC浓度均显著升高（P<0.05），表明高脂兔模型建立成功。药物干预后，与HFD组比较，BLD组中TC、TG及LDLC浓度均显著降低（P<0.05），BHD组TC、TG浓度显著降低（P<0.05），而FD组则只有TG浓度显著降低（P<0.05）。由此可见非诺贝特具有降低血清TG的作用，而小檗碱则对血清TG、TC和LDLC均有降低作用，以低剂量小檗碱作用更突出。见表1。表1 小檗碱对高脂兔血脂的影响(略)

　　2.2 小檗碱对高脂兔脂肪组织PPARγ、 INSIG2基因表达的影响

　　结果显示HFD组PPARγ 和INSIG2 mRNA表达明显高于ND组（P<0.05）；药物干预后，BLD、BHD、FD组PPARγ mRNA表达较HFD组有明显下降（P<0.05），其中BLD组作用最强，FD组次之。而BLD、BHD、FD组INSIG2 mRNA表达则较HFD组明显升高（P<0.05），其中FD组作用最强，BLD组次之。见图1。

　　3 讨 论

　　在体和离体研究表明小檗碱具有改善胰岛素抵抗、降低血糖、纠正脂质代谢紊乱的作用，但无促进胰岛素分泌作用，推测小檗碱是通过胰岛素外机制降低血糖，加之药代动力学显示小檗碱在脂肪组织中的浓度最高，提示脂肪细胞是小檗碱的主要靶细胞〔7〕。现代研究认为小檗碱具有良好的降颓、降脂、提高胰岛素敏感性及改善胰岛素抵抗的作用〔8〕，但尚未能在更深层面上揭示其作用靶点和具体作用机制。PPARγ是调节脂肪生成相关的基域，在脂肪细胞中浓度较高，是诱导脂肪细胞分化的特异性转录因子，研究发现小檗碱促进3T3L1前脂肪细胞的增殖和降低脂肪细胞胞浆中脂肪的堆积；降低脂肪细胞PPARγ mRNA的表达和抑制PPARγ蛋白质水平。最新发现小檗碱抑制3T3L1脂肪细胞分化是通过PPAR信号通路实现的〔9〕。INSIG2是新近发现的参与调控脂肪代谢的分布在内质网上的膜蛋白，通过与SCAP/SREBP复合物结合，使其滞留在内质网，阻止SREB进入高尔基体进行两次蛋白酶解加工活化，进而阻断脂肪细胞的脂质合成和分化〔10〕。有研究证明INSIG2过表达能减少Zucker糖尿病肥胖大鼠和禁食再喂正常大鼠的脂肪合成〔11〕。

　　本实验结果显示，小檗碱可以明显降低血清TG、TC以及LDLC的浓度，其中低剂量组效果更明显，证明小檗碱具有良好的降血脂作用。通过实时荧光定量PCR检测脂肪组织PPARγ基因表达可见，高脂组PPARγ mRNA表达明显高于普食组，而小檗碱灌胃给药后，与高脂组相比，可显著降低PPARγ mRNA表达，由此推测小檗碱可通过抑制PPARγ的转录活性，进而抑制其下游靶基因中涉及脂肪细胞分化的如脂肪细胞结合蛋白2（aP2）、细胞分化抗原（CD36）、乙酰辅酶A氧化酶（ACO）、脂蛋白脂酶（LPL）等脂肪细胞分化成熟标记物，从而抑制前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化，减少脂肪细胞分化过程中脂质的堆积。对脂肪组织INSIG2基因表达检测结果显示，高脂组INSIG2 mRNA表达较普食组明显上调，在小檗碱干预后，INSIG2 mRNA表达较高脂组显著升高，其中低剂量组上调作用更为明显，这可能是由于INSIG2基因参与TC合成的调节，同时其自身的表达也受细胞内TC浓度的影响，当TC升高时促进INSIG2基因表达以抑制TC的合成，当胆固醇降低时则反馈性抑制INSIG2基因表达。因此，高脂组随着TC合成增加而出现代偿性INSIG2基因过表达，而高剂量小檗碱则可能与肝细胞内胆固醇合成减少而反馈性下调，而出现对INSIG2上调作用弱于低剂量小檗碱的现象。由此可见，小檗碱可通过促进INSIG2表达，而控制脂质合成与脂肪细胞分化，防止过多的脂质贮藏。综上所述，本研究证明小檗碱具有明显的降血脂作用，其作用机制与下调脂肪组织PPARγ基因表达、而上调INSIG2基因表达有关。

参考文献

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