衰老对大鼠腰骶髓排尿相关核团5羟色胺转运体表达的影响

　　　　 作者：樊平 康云霄 石葛明 王磊 张国梁 李锦

【摘要】 　　目的 观察衰老对大鼠腰骶髓排尿相关核团5羟色胺转运体表达的影响。方法 选取雄性3月龄和24月龄Wistar大鼠各6只，采用免疫组化法观察腰骶髓排尿相关核团5羟色胺转运体的免疫反应强度及其分布。切片以HPIAS1000彩色病理图文分析系统测量各月龄组大鼠灰质后连合（DGC）、中间外侧核（IML）、前角运动核（VH）、背外侧核（DLN）、球海绵体肌脊髓核（SNB）和骶副交感核（SPN）SERT免疫反应强度的灰度值。结果 3月龄及24月龄大鼠腰骶髓排尿相关核团均存在SERT免疫阳性纤维及膨体，两组所观察核团未见SERT免疫反应分布方式的改变，但表现SERT免疫反应强度的不同，24月龄组SERT免疫阳性纤维及膨体少于3月龄组大鼠。24月龄组大鼠在脊髓DGC、IML、VH、DLN及SNB的SERT免疫反应强度灰度值明显高于3月龄组(P＜0.05)。结论 老年大鼠腰骶髓排尿相关核团SERT免疫反应强度的减弱提示5羟色胺能神经纤维对这些核团支配随衰老而减少。

【关键词】 5羟色胺转运体；衰老；排尿；大鼠

　　研究显示，老年人多有排尿障碍，随着衰老而出现尿频、尿不尽等症状〔1〕，老年大鼠也有类似的排尿障碍〔2〕，这可能与排尿的神经调节或排尿器官的衰老性改变有关。脊髓参与排尿控制的传出核团位于腰骶膨大处，这些排尿相关核团接受许多下行纤维的支配，其中5羟色胺(5HT)能神经纤维的信息传递在排尿控制中起着十分重要的作用〔3～6〕。腰骶髓排尿相关核团5HT能神经体系是否随衰老出现表达降低尚不清楚。本研究利用免疫组织化学方法分析老年大鼠腰骶髓排尿相关核团5HT神经体系特异性标记物5羟色胺转运体（serotonin transporter，SERT）免疫阳性纤维和膨体分布及反应强度的变化，探讨老年排尿障碍的神经作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　选取3月龄和24月龄健康雄性Wistar大鼠12只，由河北医科大学实验动物中心提供，每月龄组各6只。

　　1.2 仪器与试剂

　　CM1850恒冷箱冷冻切片机（德国Leica公司产品），HPIAS1000 高清晰度彩色病理图文分析系统（武汉长海科技有限责任公司产品）；多克隆兔抗SERT抗体购自美国ImmunoStar公司，山羊抗兔生物素化二抗及链霉亲和素过氧化物酶复合物购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.3 免疫组织化学及图像分析

　　所有大鼠于深麻醉下以4%多聚甲醛常规经心灌注固定，取第1、第2腰髓节段（L1～L2）和第6腰髓到第1骶髓（L6～S1）节段后固定4 h，加入30%蔗糖溶液4 ℃过夜。将所取部位横断面冷冻切片（40 μm）、间断集片，经PBS洗片后行SABC免疫组织化学显色。步骤：正常血清室温孵育切片30 min、1∶2 000多克隆SERT抗体4℃孵育48 h、1∶500生物素化二抗室温孵育2 h、1∶500链霉亲和素过氧化物酶复合物室温孵育1 h、DAB显色5 min；常规梯度脱水、透明、封片。阴性对照实验以PBS替代一抗。切片以HPIAS1000彩色病理图文分析系统测量各月龄组大鼠灰质后连合（dorsal grey commissure，DGC）、中间外侧核（intermediolateral nucleus，IML）、前角运动核（VH）、背外侧核（dorsal lateral nucleus，DLN）、球海绵体肌脊髓核（spinal nucleus of the bulbocavernosus，SNB）和骶副交感核（sacral parasympathetic nucleus，SPN）SERT免疫反应强度的灰度值。

　　1.4 统计学方法

　　数据以x±s表示，经方差齐性检验后行成组设计的t检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠腰骶髓排尿相关核团SERT免疫组化

　　脊髓腰骶部排尿相关核团含有较丰富的SERT免疫阳性纤维及膨体，点状的免疫反应膨体分布于核团神经元胞体周围。两组大鼠核团SERT免疫阳性纤维和膨体的分布方式未见明显区别，但免疫反应强度在两组存在显著差异，24月龄组SERT免疫阳性纤维及膨体在DGC、IML、VH、DLN和SNB少于3月龄组。见图1。

　　2.2 衰老对大鼠腰骶髓排尿相关核团SERT免疫反应强度的影响

　　与3月龄组比较，24月龄组所观察的部分核团SERT免疫反应阳性纤维和膨体的灰度值显著增加；在DGC升高了13.3%；IML、VH、DLN和SNB分别升高了10.7%、8.3%、12.4%和5%。两组SPN处SERT免疫反应阳性纤维和膨体的灰度值无显著差异，仅存在升高的趋势。见表1。表1 衰老对大鼠腰骶髓排尿相关核团SERT免疫反应强度的影响(略)

　　3 讨 论

　　SERT是位于5HT能神经末梢的一种膜蛋白，从突触间隙中重摄取5HT入突触前末梢，从而调节5HT的作用强度和时间，其表达变化直接影响5HT能神经元参与的神经活动。研究表明，SERT比5HT更能准确反映脑内5HT能神经体系的变化〔7〕。本研究显示，DGC、IML、VH、DLN和SNB的SERT免疫反应阳性纤维和膨体显著减少，SPN处虽无显著差异，但也存在降低趋势。利用SPECT/PET方法显示老年人脑中缝背核SERT配基结合信号减少的结果〔8〕支持本研究结果。以往运用高效液相色谱分析法（HPLC）的研究虽未见腰骶髓5HT的年龄变化，但观察到5HT代谢产物5HIAA（五羟吲哚乙酸）水平的改变〔9〕，与本研究观察结果的差异很可能与用于HPLC检测的脊髓组织不仅含有灰质，还含有白质干扰了结果分析有关。

　　腰骶髓排尿相关核团在维持下尿路正常的储存和排尿这两个功能上起着十分重要的作用，大鼠脊髓的SNB和DLN与人Onuf核相似，两核团的运动神经元发出纤维通过阴部神经支配尿道外括约肌或盆底肌群；腰1～腰2节段IML、DGC的交感节前神经元以及SPN的副交感节前神经元通过投射到相应的节后神经元而支配膀胱和尿道的平滑肌；而腰5～骶1节段DGC的部分中间神经元可能参与调控支配膀胱平滑肌的副交感节前神经元的活动〔10～12〕。老年大鼠腰骶髓这些核团5HT转运体免疫反应阳性纤维和膨体的减少提示，5HT能神经纤维对腰骶髓排尿相关核团神经元支配的减弱，这很可能与老年排尿障碍有关，但其详细机制还有待进一步探究。

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