零下非结冰保存L02细胞的效果及与细胞凋亡的关系

　　　　 作者：李庆勇 张清华 蒋知新 李安全 夏爱祥 李丽 陈玲 高毅

【摘要】 　　目的 采用UW液零下非结冰（-0.8℃）保存生物人工肝用L02细胞，与常规低温（4℃及0℃）比较，探索零下非结冰保存肝细胞的效果以及同细胞凋亡的关系。方法 制备好的UW液保存的L02细胞悬液分为3组：-0.8℃组（零下非结冰组），0℃组（0℃非结冰组），4℃组（对照组）。低温保存24 h、48 h及72 h后，分别测定细胞存活率及凋亡率（流式细胞术）、LDH释放、尿素合成功能、白蛋白分泌功能。结果 零下非结冰（-0.8℃）较常规低温（0℃及4℃）明显提高了低温保存L02细胞的存活率〔72 h：-0.8℃（70.17±2.82）% vs 4℃（60.05±3.17）%〕，降低了细胞凋亡率〔72 h：-0.8℃（5.73±1.68）% vs 4℃（9.20±2.35）%〕。零下非结冰明显抑制了LDH的释放〔72 h：-0.8℃（113.88±5.64）U/L vs 4℃（170.47±11.80）U/L〕，更好地维持了L02细胞的尿素合成功能〔72 h：-0.8℃（1.01±0.14）mmol/L vs 4℃（0.66±0.09）mmol/L〕及白蛋白分泌功能〔72 h：-0.8℃（9.04±0.53）μg/ml vs 4℃（7.70±0.52）μg/ml〕。结论 与0℃及4℃相比，零下非结冰（-0.8℃）可明显提高L02细胞存活率，降低低温损伤引起的细胞凋亡，有效的保护肝细胞尿素合成功能和白蛋白分泌功能。

【关键词】 生物人工肝；零下非结冰

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect and the relationship with cell apoptosis of subzero nonfreezing storage(-0.8℃) compared with conventional hypothermic storage （4℃ and 0℃）using L02 hepatocytes which were stored in UW solution and used by bioartificial live support system. Methods L02 hepatocytes suspended in UW solution were pided into subzero nonfreezing (-0.8℃)， zero nonfreezing (0℃) and control groups (4℃). After 24，48 and 72 h of hypothermic storage， the cell viability rate and cell apoptosis rate(flow cytometry)， the level of lactate dehydrogenase(LDH)， the ability of hepatocytes to synthesize urea and secrete albumin were measured. Results Significant improvement of cell viability 〔72 h：-0.8℃（70.17±2.82）% vs 4℃（60.05±3.17）%〕 was observed in subzero nonfreezing group(-0.8℃) compared with that in zero nonfreezing group(0℃) and control group (4℃).Cell apoptosis 〔72 h：-0.8℃（5.73±1.68）% vs 4℃（9.20±2.35）%〕 and LDH 〔72 h：-0.8℃（113.88±5.64）U/L vs 4℃（170.47±11.80）U/L〕 were significantly suppressed and the ability of hepatocytes to synthesize urea 〔72 h：-0.8℃（1.01±0.14）mmol/L vs 4℃（0.66±0.09）mmol/L〕 and secrete albumin 〔72 h：-0.8℃（9.04±0.53）μg/ml vs 4℃（7.70±0.52）μg/ml〕 were also better maintained in subzero nonfreezing group. Conclusions Subzero nonfreezing storage(-0.8℃) of L02 hepatocytes stored in UW solution could pride better cell viability， the ability of hepatocytes to synthesize urea and secrete albumin and lower cell apoptosis. Subzero nonfreezing storage(-0.8℃) of hepatocytes and constructing a “ready to use” hepatocytes bank which likes the blood bank will efficiently promote the development of the BLASS.

　　【Key words】 Bioartificial live support system; BALSS; Subzero nonfreezing; SZNF

　　生物人工肝（bioartificial live support system，BALSS）的发展为老年终末期肝功能衰竭的治疗开辟了新的途径，而生物功能好的肝细胞是BALSS的核心〔1〕。所以，探索出一种实用的肝细胞保存方法，建立一个肝细胞库是BALSS普遍推广的基础〔2〕。温度是影响低温保存效果的关键因素：温度越低，细胞的代谢活性就越低，保存时间就越长〔3〕。零下非结冰温度（subzero nonfreezing temperature，SZNFT）是指0℃到某溶液冰点之间的温度范围，一方面可以使代谢降至最低，不同于常规低温保存（4℃）；另一方面可以避免深低温冻存（-196℃）引起的“细胞内冰晶”、“渗透性休克”等损伤〔4〕，理论上零下非结冰是一种理想的细胞保存形式〔5〕。因此，本文将用器官保存液（UW液）（冰点-1℃）-0.8℃保存L02细胞，同常规低温（0℃及4℃）比较，以明确零下非结冰保存肝细胞的效果以及同细胞凋亡的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　L02永生化肝细胞株（中国医学科学院）；DMEM/F12培养基、优级胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素溶液（100倍）、重组人表皮生长因子（EGF）、胰岛素溶液、0.25%胰酶及磷酸盐缓冲液（PBS）（Invitrogen，美国）；UW液（BristolMyers Squibb）；50 ml培养瓶、2 ml冻存管及6孔培养板（Costar Corning）；氯化铵（Sigma）；人白蛋白ELISA试剂盒(R&D，美国)，Mode1450型酶标仪（BIORAD，美国）；CK2型倒置显微镜（Olympus，日本）；膜联蛋白（AnnexinV）荧光素（FITC）凋亡试剂盒（南京凯基）；DXC800型全自动生化仪及FACScan型流式细胞仪（Beckmancoulter，美国）；MIR151型微电脑程控低温培养箱（温度范围：-10℃～60℃，温度精度：±0.1℃）及MCO175型二氧化碳培养箱（SANYO，日本）。海尔智能温度记录仪（温度范围：-100℃～+120℃，精度±0.1℃）。超净工作台（北京昌平长城空气净化工程公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验分组

　　将制备好的UW液保存的L02细胞悬液分为3组：①-0.8℃组（零下非结冰组），②0℃组（0℃非结冰组），③4℃组（对照组）。

　　1.2.2 细胞培养及制备

　　所用基础培养液为DMEM/F12，添加青霉素：10 U/ml，链霉素：10 mg/ml，10%FBS（v/v）。于37℃，5% CO2，100%湿度的培养箱内培养。内壁长满后，0.25%胰酶消化，制备成L02细胞悬液，血细胞计数板计数，最终将细胞浓度调至2×106/ml，分装至2 ml冻存管。

　　1.2.3 低温保存及复温

　　2 ml冻存管，置换为2 ml UW液，分别至-0.8℃组、4℃组低温保存（每组18个标本）；分别保存24、48、72 h后，每组取6个标本，放入37℃水浴中震荡1～2 min；复温后将UW液置换为培养液2 ml，于培养箱内培养30 min。

　　1.2.4 复温后各指标的测定

　　①取1 ml细胞悬液，加到1 ml含4 mmol/L氯化铵培养液的6孔培养板中，于培养箱内培养24 h后，取上清，测定尿素的浓度及人白蛋白含量（按照白蛋白ELISA kit说明）。②剩余1 ml细胞悬液，1 000 r/min，离心2 min。取上清测定乳酸脱氢酶（LDH）。沉淀的细胞于流式细胞仪定量测定细胞存活率、凋亡率及死亡率（按照AnnexinVFITC凋亡试剂盒要求）。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS13.0统计软件分析，所有计量资料以x±s表示。同时间点不同组样本均数比较采用oneway ANOVA，多重比较采用LSD检验，方差不齐时多重比较采用多个孤立样本非参数分析KruskalWallis检验。

　　2 结 果

　　2.1 不同溶液的降温曲线及冰点

　　2.1.1 蒸馏水的降温曲线

　　当温度缓慢降至-3℃时，蒸馏水仍呈液态，蒸馏水的温度突然升至0℃时，冰晶开始形成，完全结冰后，蒸馏水的温度随着外界温度的下降而下降。因此，蒸馏水的冰点是0℃。见图1A。

　　2.1.2 UW液的降温曲线

　　当温度缓慢降至-7℃时，UW液仍然呈液态，继续降温，冰晶开始形成，温度突升至-1℃，完全结冰后，UW液的温度随着外界温度的下降而下降。因此，UW液的冰点是-1℃，SZNFT为0℃～-1℃。见图1B。

　　2.1.3 L02细胞

　　当温度缓慢降至-4℃时，L02细胞外无冰晶形成，继续降温，冰晶开始形成，温度升至-1℃。因此L02细胞冰点为-1℃，L02细胞的SZNFT为0℃～-1℃。见图1C。

　　2.2 不同低温保存时间细胞存活率、凋亡率及死亡率

　　新鲜细胞存活率为：（86.95±0.58）%，凋亡率为：（1.73±0.19）%，死亡率为（4.72±0.38）%。随低温保存时间延长，各组细胞存活率呈下降趋势，48 h、-0.8℃组细胞存活率与0℃组及4℃组相比开始出现差异；72 h，各组细胞存活率明显下降，-0.8℃组明显优于0℃组及4℃组。随时间延长，各组细胞凋亡率呈上升的趋势，48 h，-0.8℃组细胞凋亡率同0℃组及4℃组相比开始出现差异；72 h，各组细胞凋亡率明显增加，-0.8℃组明显低于0℃组及4℃组；各组细胞死亡率随时间呈上升的趋势，但是各时间点各组无统计学差异。见表1～3，图2。表1 不同低温保存时间复温后细胞存活率比较（略）表2 不同低温保存时间复温后细胞凋亡率比较（略）表3 不同低温保存时间复温后细胞死亡率比较（略）

　　2.3 不同低温保存时间LDH释放水平

　　新鲜细胞LDH释放为（49.52±2.27）U/L。随着低温保存时间的延长，反应细胞损伤程度的LDH释放呈上升的趋势。48 h，-0.8℃组LDH释放同0℃组及4℃组相比开始出现差异；72 h，各组LDH释放明显增加，-0.8℃组明显低于0℃组及4℃组。因此，零下非结冰（-0.8℃）明显减轻了细胞低温保存损伤。见表4。表4 不同低温保存时间上清LDH值（略）

　　2.4 不同保存时间尿素合成情况（氯化铵转化试验）

　　新鲜细胞尿素合成为（2.63±0.19）mmol/L。随保存时间的延长，L02细胞尿素合成功能呈下降趋势。48 h，-0.8℃组尿素合成与0℃组及4℃组相比开始出现差异；72 h，各组尿素合成明显降低，-0.8℃组明显优于0℃组及4℃组。因此，零下非结冰（-0.8℃）较好地维持细胞尿素合成功能。见表5。表5 不同低温保存时间尿素合成水平（略）

　　2.5 不同保存时间白蛋白分泌量

　　新鲜细胞白蛋白分泌量为（11.90±0.19）μg/ml。随保存时间的延长，L02细胞白蛋白分泌功能呈下降趋势。48 h，-0.8℃组白蛋白分泌功能同0℃组及4℃组相比开始出现差异；72 h，-0.8℃组明显优于0℃组及4℃组。因此，零下非表6 不同低温保存时间白蛋白分泌水平（略）

　　3 讨 论

　　目前肝细胞低温保存分为两大类：①-80℃或-196℃深低温冻存（Crypreservation）。②4℃低温保存（Hypothermic preservation）。为获得较高的细胞存活率及延长低温保存时间，许多学者对多种冻存保护剂进行了研究，但是“细胞内冰晶”、“渗透性休克”、“二甲基亚砜（DMSO）肝细胞毒性作用”及复温引起的“细胞凋亡”是深低温冻存无法逾越的障碍〔4〕。4℃常规低温保存肝细胞48 h后细胞存活率明显下降，因此，更多的研究者开始把肝细胞低温保存转向零下非结冰〔6〕。SZNFT一方面可以使代谢降至最低，不同于常规低温保存（4℃）；另一方面可以避免“细胞内冰晶”、“渗透性休克”等损伤。不同溶液的冰点及SZNFT不同，蒸馏水的为0℃，UW液及L02细胞的为0℃～-1℃。UW液的冰点是-1℃，MIR151控温精度为±0.1℃，为了避免低温保存过程中冰晶形成，所以本研究用UW液于-0.8℃低温保存L02细胞，且缓慢降温（温度由4℃降至-0.8℃时间大于60 min）。

　　细胞膜及细胞内细胞器质膜的完整性程度是影响细胞功能的重要因素〔7〕。本研究通过Annexin VFITC/碘化乙啶双染法，使用流式细胞仪测定细胞存活率及凋亡率发现：-0.8℃较4℃及0℃明显维持了细胞膜的完整性、提高了低温保存48 h及72 h L02细胞的存活率，减少了L02细胞凋亡率。不同低温保存时间点，-0.8℃较4℃及0℃均明显抑制了反应细胞膜损伤程度的LDH的释放。Rodriguez〔8〕用UW液保存胶原酶法分离的鼠肝细胞120 h发现：超冷温度（-4℃）较0℃明显提高了细胞存活率，减轻了细胞膜低温保存损伤，可能系零下非结冰明显抑制了细胞代谢，提高细胞内ATP含量以及糖原含量有关，同本研究结果基本一致。

　　作为BLASS生物材料体外培养的肝细胞，应具备体内肝细胞氨基清除功能（氯化铵转化试验）及白蛋白分泌等主要功能〔9〕，而低温保存均可不同程度的损伤肝细胞转化、分泌功能。

　　Calligaris〔10〕用UW液4℃保存鼠肝细胞72 h，发现低温保存的肝细胞氨基清除能力和尿素合成能力同新鲜细胞无明显差异。Almada〔11〕进一步用UW液0℃保存鼠肝细胞120 h，测定尿素合成过程中两重要限速酶（氨甲酰基合成酶Ⅰ及鸟氨酸合成酶）活性及基因的表达。结果显示0℃低温保存肝细胞同新鲜分离鼠肝细胞的尿素合成酶的活性及基因表达无统计学差异。本研究零下非结冰保存L02细胞， 各时间点-0.8℃较4℃及0℃均更好的维持了肝细胞的氨基清除（尿素合成）功能及白蛋白分泌功能。
　　
　　有关肝细胞在低温保存过程中死亡的机制尚未完全阐明，除了冰晶形成、渗透压改变及化学改变如pH外，Fu〔12〕在肝细胞深低温冻存复苏后，采用膜联蛋白相关的TUNEL法、流式细胞术及DNA梯度分析发现：同未冻存细胞相比，冻存后细胞凋亡指数明显增加。Kao〔13〕用UW液4℃低温保存鼠肝细胞24 h发现：同新鲜细胞相比，低温保存细胞凋亡指数明显增加，同时伴有热休克蛋白（HSP）表达的下降。因此，细胞凋亡是除了坏死之外，低温保存肝细胞死亡的另一个重要途径。本研究也通过流式细胞术分析发现：零下非结冰（-0.8℃）较0℃及4℃明显提高了低温保存L02细胞的存活率，而存活率的提高主要是通过降低细胞凋亡实现的。

　　细胞凋亡有两个独立的途径：①死亡受体途径（外源性途径即由Fas/CD95和TNFR介导的通路）；②线粒体途径〔内源性途径即细胞色素C（CtyC），半脱氨酸蛋白酶3（Caspase3）〕等介导的通路。关于低温保存引起细胞凋亡的具体机制仍然不清楚，但也取得了一定的进展：Fu〔14〕将肝细胞由37℃降至32℃培养12 h，采用流式细胞术及DNA梯度分析凋亡相关因子（Fas）介导的细胞凋亡作用。结果显示：低温抑制了Fas介导的细胞凋亡。

　　Matsushita等〔15〕在冻存前细胞培养液中加入25 mmol/L广细胞谱凋亡蛋白酶抑制剂IDN1965，液氮冻存2 w后复苏，立即检测细胞凋亡指数（TUNEL法）、caspase3活性及CtyC释放。结果发现IDN1965明显提高了细胞存活率，抑制了caspase3活性及CtyC释放。因此，线粒体途径相关的细胞凋亡在细胞冻存损伤中发挥了重要的作用。

　　总之，同常规低温（4℃及0℃）相比，使用UW液零下非结冰（-0.8℃）保存肝细胞可以明显的提高复温后细胞存活率，降低低温损伤引起的细胞凋亡，有效的保护肝细胞尿素合成功能和白蛋白分泌功能。采用零下非结冰保存肝细胞，建立“血库样”肝细胞库，可以有效地促进BLASS的发展。
　

参考文献

　　1 Fiegel HC，Kaufmann PM，Bruns H，et al.Hepatic tissue engineering：from transplantation to customized cellbased liver directed therapies from the laboratory〔J〕.J Cell Mol Med，2008；12(1):5666.

　　2 Lloyd TD，Orr S，Berry DP，et al.Development of a protocol for cryopreservation of hepatocytes for use in bioartificial liver systems〔J〕.Ann Clin Lab Sci，2004；34(2):16574.

　　3 Llarrull MS，Pizarro MD，Scandizzi AL，et al.Cold preservation of isolated hepatocytes in UW solution:experimental studies on the respiratory activity at 0 degrees C〔J〕.Cryo Letters，2007；28(5):31328.

　　4 Fleming KK，Hubel A.Cryopreservation of hematopoietic and nonhematopoietic stem cells〔J〕.Transfus Apher Sci，2006；34(3):30915.

　　5 Soltys KA，Batta AK，Koneru B.Successful nonfreezing，subzero preservation of rat，liver with 2，3butanediol and type i antifreeze protein〔J〕.J Surg Res，2001；96(1):304.

　　6 Guibert EE，Almada LL，Mamprin ME，et al.Subzero nonfreezing storage of rat hepatocytes using UW solution and 1，4butanediol.II functional testing on rewarming and gene expression of urea cycle enzymes〔J〕.Ann Hepatol，2009；8(2):12933.

　　7 Katenz E，Vondran FW，Schwartlander R，et al.Cryopreservation of primary human hepatocytes：the benefit of trehalose as an additional cryoprotective agent〔J〕.Liver Transpl，2007；13(1):3845.

　　8 Rodríguez JV，Almada LL，Mamprin ME，et al.Subzero nonfreezing storage of rat hepatocytes using modified University of Wisconsin solution (mUW) and 1，4butanediol.I effects on cellular metabolites during cold storage〔J〕.Ann Hepatol，2009；8(1):5762.

　　9 Demetriou AA，Brown RS Jr，Busuttil RW，et al.Prospective，randomized，multicenter，controlled trial of a bioartificial liver in treating acute liver failure〔J〕.Ann Surg，2004；239(5):6607.
　　
　　10 Calligaris SD，Almada LL，Guibert EE，et al.Ammonium detoxifying activity is maintained after 72 hours of cold preservation of rat hepatocytes in University of Wisconsin (UW) solution〔J〕.Cryo Letters，2002;23(4):24554.

　　11 Almada L，Bellarosa C，Giraudi P，et al.Gene expression and activity of urea cycle enzymes of rat hepatocytes cold stored up to 120h in University of Wisconsin solution〔J〕.Cryobiology，2006；52(3):393400.

　　12 Fu T，Guo D，Huang X，et al.Apoptosis occurs in isolated and banked primary mouse hepatocytes〔J〕.Cell Transplant，2001；10(1):5966.

　　13 Kao YH，Goto S，Jawan B，et al.Heat preconditioning ameliorates hepatocyte viability after cold preservation and rewarming，and modulates its immunoactivity〔J〕.Transpl Immunol，2008；18(3):22031.

　　14 Fu T，Blei AT，Takamura N，et al.Hypothemia inhibits Fasmediated apoptosis of primary mouse hepatocytes in culture〔J〕.Cell Transplant，2004；13(6):66776.

　　15 Matsushita T，Yagi T，Hardin JA，et al.Apoptotic cell death and function of cryopreserved porcine hepatocytes in a bioartificial liver〔J〕.Cell Transplant，2003；12(2):10921.