氟伐他汀对诱导分化的HL60细胞VEGF mRNA表达的抑制作用

　　　　作者：赵丽艳 林海 石艳 苗春生 李蕴潜

【摘要】 　　目的 探讨氟伐他汀（fluvastatin，Flu）对诱导分化的HL60人早幼粒细胞白血病细胞（HL60细胞）血管内皮生长因子 (VEGF) mRNA表达的抑制作用及其机制。方法 将体外培养的HL60细胞随机分为空白对照组、阳性对照组、Flu处理组和Flu+ 甲羟戊酸（Mev）处理组。Flu处理组和Flu+Mev处理组加入终浓度为20 μmol/L的Flu，Flu+ Mev处理组在加入Flu的同时加入终浓度Mev 100 μmol/L，阳性对照组加入终浓度ATRA 10 μmol/L，空白对照组加入等体积二甲基亚砜（DMSO），作用72 h后收获细胞。细胞处理72 h后检测NBT还原能力；应用RTPCR检测各组HL60细胞VEGF mRNA表达水平。结果 Flu处理组细胞NBT还原能力（0.63±0.09）较对照组（0.22±0.06）显著升高（P＜0.01），Flu+ Mev处理组细胞NBT还原能力明显降低（0.34±0.04）（P＜0.01），表明Flu已诱导HL60细胞分化，而加入甲羟戊酸可以逆转Flu的诱导分化作用。阳性对照组和Flu处理组VEGF mRNA表达水平分别为1.51±0.02和1.58±0.04，均较空白对照组（1.87±0.05）明显下调（P＜0.01）；Flu+ Mev处理组逆转由Flu诱导VEGF mRNA表达的下调（1.76±0.06），与Flu处理组比较具有统计学意义（P<0.05）。结论 Flu能抑制已分化的HL60细胞VEGF基因表达，这种作用可能是通过“甲羟戊酸途径”介导的。

【关键词】 氟伐他汀；HL60细胞；血管内皮生长因子；甲羟戊酸途径

　　肿瘤血管生成能力增强不仅导致肿瘤细胞数量迅速增加，而且增加了肿瘤转移的危险性。肿瘤细胞能产生多种血管生长因子，其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是与血管生成关系最密切的生长因子，VEGF不仅对实体瘤的发生发展产生明显影响，而且在多数造血系统恶性肿瘤中也起重要作用〔1〕，抑制VEGF表达或活性已成为造血系统恶性肿瘤治疗的新策略〔2，3〕。以往研究表明，氟伐他汀（fluvastatin，Flu）能抑制HL60人早幼粒细胞白血病细胞（HL60细胞）增殖并诱导凋亡〔4〕，但Flu对诱导分化的HL60细胞VEGF mRNA表达的影响尚未见报道。本研究着重探讨Flu对诱导分化的HL60细胞血管内皮生长因子 VEGF mRNA表达的抑制作用及其机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　HL60细胞（中国医学科学院天津血液研究所），RPMI 1640培养基（Gibco公司），小牛血清（Hycolon公司），Flu（北京诺华制药有限公司），全反式维甲酸（ATRA），甲羟戊酸（mevalonate，Mev），硝基四氮唑蓝（NBT），牛血清白蛋白、二甲基亚砜（DMSO）、佛波酯（Sigma公司），VEGF及βactin引物（上海生工生物技术公司合成）。

　　1.2 细胞培养

　　HL60细胞在含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，37℃、5% CO2培养箱饱和湿度下培养。

　　1.3 细胞的处理

　　收集对数生长期细胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液配成105/ml浓度的细胞悬液，接种于培养瓶中，随机分为空白对照组、阳性对照组、Flu处理组和Flu+ Mev处理组。Flu处理组和Flu+ Mev处理组加入终浓度为20 μmol/L的Flu，Flu+ Mev处理组在加入Flu的同时加入终浓度Mev 100 μmol/L，阳性对照组加入终浓度ATRA 10 μmol/L，空白对照组加入等体积DMSO，作用72 h后收获细胞。

　　1.4 NBT还原能力测定

　　各组经不同处理的HL60细胞接种于24孔板处理72 h后，每孔加入含1.25 mg/ml NBT、17 mg/ml牛血清白蛋白及2 μg/ml佛波酯的PBS溶液，37℃温育2 h。离心弃上清液，加入3 ml DMSO溶解结晶物，用721型分光光度计测580 nm处吸光度（A），以A值大小表示细胞NBT还原能力。NBT还原能力测定是判断细胞分化的标志物和敏感指标，在一定波长下其吸光度值越大细胞的还原能力越强，而未分化的白血病细胞则缺乏这种还原能力，故吸光度值低。

　　1.5 VEGF mRNA表达的检测

　　取经不同处理的HL60细胞，按Trizol试剂盒说明书操作方法提取总RNA。用紫外分光光度计在260 nm和280 nm处测A值，OD260/OD280在1.8～2.0，根据A260值计算RNA浓度。按逆转录试剂盒操作说明将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，分别用VEGF和βactin的引物进行PCR扩增。VEGF上游引物：5′TCGGGCCTCCGAAACCATGA3′，下游引物：5′CCTGGTGAGAGATCTGGT TC3′，扩增产物为516 、588 和648 bp。βactin上游引物：5′TCAGGTCATCACTATCGGCAAT3′，下游引物：5′AAAGAAAGGGTGTAAAA CGCA3′，扩增产物为432 bp。取PCR产物进行2%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/ml溴化乙锭），3 V/cm电泳30～50 min，紫外灯下照相，用凝胶成像处理系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片断（VEGF和βactin）进行灰度扫描，以βactin密度作为参考定量标准，数值以两者之积分吸光度的比值表示，以对照组的比值作为标准1.0。

　　1.6 统计学方法

　　数据以x±s表示，显著性检验采用SPSS 11.0软件，组间比较采用方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 NBT还原能力

　　用Flu处理HL60细胞72 h后，其NBT还原能力（0.63±0.09）较对照组(0.22±0.06)显著升高（P＜0.01），接近阳性对照组（0.76±0.16）的水平。Flu+ Mev处理组HL60细胞NBT还原能力（0.34±0.04） 与Flu处理组比较明显降低（P＜0.01）。表明Flu可诱导HL60细胞分化，而Mev能够逆转Flu的诱导分化作用。

　　2.2 VEGFmRNA表达

　　HL60细胞经ATRA和Flu处理72 h后，VEGF mRNA表达水平（分别为1.51±0.02和1.58±0.04）均较阴性对照组（1.87±0.05）明显下调（P＜0.01）。Flu+ Mev处理组VEGF mRNA表达的下调（1.76±0.06），与Flu处理组比较具有统计学意义（P<0.05）（图1）。

　　3 讨 论

　　近年研究表明，某些恶性肿瘤细胞在诱导剂的作用下，可以重新分化为正常或接近正常的细胞，即肿瘤细胞的诱导分化，这种疗法已成为肿瘤治疗的新方向。本研究中，用Flu处理HL60细胞72 h后，其NBT还原能力较对照组显著升高，接近阳性对照组的水平，表明Flu已诱导HL60细胞发生了分化。用Flu和Mev共同处理后HL60细胞NBT还原能力又明显降低，提示Mev可以逆转Flu的诱导细胞分化作用。

　　研究发现，恶性血液病细胞VEGF呈高表达，并不同程度表达VEGF受体〔1〕。抑制VEGF生物学作用可能会直接抑制血液肿瘤的生长和存活〔5〕，并将抗血管治疗概念从实体瘤引入血液肿瘤研究中，这是近年对抗血管生成治疗白血病认识的进一步深化。本研究显示，HL60细胞经Flu处理72 h后VEGF mRNA表达水平明显降低，表明Flu能抑制已分化的HL60细胞VEGF基因表达。
　　
　　目前有关研究显示，微摩尔浓度的他汀类药物能降低VEGF合成〔6〕。Araujo等观察到阿托伐他汀能通过下调VEGF表达而抑制炎性血管生成〔7〕，但尚不清楚Flu通过何种机制引起VEGF基因表达下调。本研究发现，HL60细胞用Flu和Mev共同处理后，可以逆转由Flu诱导VEGF mRNA表达的下调，即可使已下调的VEGF mRNA表达水平又增加到接近于空白对照组的水平，提示Flu下调VEGF基因表达的作用可能是通过“甲羟戊酸途径”介导的。Hata等〔8〕用视网膜内皮细胞研究辛伐他汀的抗血管生成作用时也证实，抑制甲羟戊酸依赖途径是Flu这一作用的可能机制。甲羟戊酸是HMGCoA还原酶反应的重要产物，他汀类药物能抑制甲羟戊酸及其下游产物的生成，阻断蛋白质翻译后的异戊二烯化加工，干扰小G蛋白Ras介导的细胞内信号传导，从而影响细胞的生物学功能〔9，10〕。

　　有研究表明〔10〕，除了降低胆固醇作用外，他汀类在体内体外都显示出抗白血病作用，Flu与其他抗肿瘤药物合用，可增强肿瘤细胞对放疗的敏感性，增强ATRA对急性早幼粒细胞白血病细胞诱导的分化，逆转ATRA抗白血病作用的抗药性，减少化疗药物的用量及毒副作用，提示Flu具有多方面有益作用，在急性粒细胞白血病的治疗中可能具有良好的应用前景。

参考文献

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　　4 赵丽艳，石 艳，王忠山，等.氟伐他汀对人早幼粒白血病HL60细胞增殖和凋亡的影响〔J〕.吉林大学学报 (医学版)，2008；34(2)：2547.

　　5 Dias S，Choy M，Alitalo K，et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF)C signaling through FLT4 (VEGFR3) mediates leukemic cell proliferation，survival，and resistance to chemotherapy〔J〕.Blood，2002；99(6)：217984.

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　　10 Buhaescu I，Izzedine H.Mevalonate pathway：a review of clinical and therapeutical implications〔J〕.Clin Biochem，2007；40(910)：57584.