雌激素对去势高脂血症C57BL/6模型小鼠ZFP580 mRNA表达的影响

　　 作者：孙慧燕 翁立军 赵延玲 陈劭煜 张旭 韦淑萍 张文成

【摘要】 　　目的 探讨雌激素对C57BL/6小鼠主动脉中ZFP580基因表达的影响。方法 建立假手术组、去势对照组（卵巢切除）、去势实验组（卵巢切除并腹腔内注射苯甲酸雌二醇）C57BL/6小鼠高脂血症模型并鉴定；提取C57BL/6小鼠主动脉总RNA，设计并合成ZFP580及βactin基因的引物，利用半定量RTPCR方法分析ZFP580的mRNA水平。结果 成功构建去势C57BL/6小鼠高脂血症模型；去势对照组小鼠ZFP580基因表达水平与假手术组和实验组相比均下降（P<0.05），而后两者表达水平比较无显著差异(P＞0.05)。结论 小鼠在摘除卵巢失去雌激素的调控后，ZFP580基因表达下调，小鼠在去势后定期给予雌激素，ZFP580基因表达回复至假手术组水平，说明雌激素能够上调ZFP580基因表达。

【关键词】 ZFP580基因；雌激素；高脂血症；动脉粥样硬化；C57BL/6小鼠

　　【Abstract】Objective To investigate the effect of estrogen on ZFP580 gene expression in the aortic tissue of C57BL/6 mice. Methods The C57BL/6 mice were made hyperlipidemia model and pided into three groups: shamovariectomized，ovariectomized and ovariectomized with estrogen groups.Then the ZFP580 gene expressions were analyzed by semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction （RTPCR） in the three groups. Results Results The ratio of ZFP580 gene and βactin gene was significantly lower in the ovariectomized group than that of shamovariectomized and ovariectomized with estrogen the other two groups (P<0.05).While the ratio was similar between the shamovariectomized group and ovariectomized with estrogen group. Conclusions Without estrogen，ZFP580 gene expression in the ovariectomized group are downregulated.The expression of ZFP580 gene in the ovariectomized with estrogen group restores to the level of that of the shamovariectomized group.Estrogen can increase the expression of ZFP580 gene.

　　【Key words】ZFP580 gene; Estrogen; Hyperlipidemia; Atherosclerosis; C57BL/6 mice

　　妇女绝经后高脂血症和动脉粥样硬化（AS）的发生与体内性激素环境的变化密切相关〔1，2〕。人ZNF580基因（Gene ID：51157）编码一种与AS相关的具有调控作用的锌指蛋白核转录因子〔3～5〕，而与人ZNF580结构完全一致的小鼠源性同源基因ZFP580（注册号为AK005257）仅由日本RIKEN基因组中心完成序列测定〔6，7〕。GenBank的GEO数据库的基因芯片资料表明，雌激素等物质可影响ZFP580基因的表达。本研究利用半定量RTPCR方法，探讨了ZFP580基因在去势高脂血症模型小鼠主动脉中的表达情况；为在动物整体、基因转录水平阐明ZFP580基因在AS发生、发展中的作用奠定了基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与材料

　　8周龄C57BL/6雌鼠（45～50 g）42只，由军事医学科学院动物中心购得。Trizol购自Invitrogen，RTPCR试剂盒购自TakaRa公司，引物由上海Sangon公司合成。苯甲酸雌二醇购自本院附属医院药房。

　　1.2 小鼠去势高脂血症模型的建立及鉴定

　　清洁级8周龄C57BL/6雌鼠42只。动物饲以正常饲料适应性饲养1 w后随机分成3组，即假手术组（14只，行假手术，不切除卵巢），去势对照组（14只，行双侧卵巢切除术），去势实验组（14只，行双侧卵巢切除术并腹腔内注射苯甲酸雌二醇）。各组均于手术2 w后饲以“西方膳食”饲料(含脂肪21％、胆固醇0.15％)，其他实验条件不变。实验组同时以1 μg/g的剂量腹腔内注射苯甲酸雌二醇，每日1次，连续用药7 w。动物处死前禁食12 h，2.5％戊巴比妥0.4～0.5 ml经腹腔麻醉小鼠。摘眼球采血，室温静置1 h后，500 g×10 min离心，取血清上样于全自动生化分析仪，检测总胆固醇和低密度脂蛋白含量。

　　1.3 小鼠主动脉总RNA的提取

　　按Trizol试剂盒说明书提取C57BL/6小鼠主动脉的总RNA。紫外分光光度计检测RNA纯度及定量。

　　1.4 目的片段的RTPCR扩增

　　1.4.1 引物的设计与合成

　　根据GenBank中鼠ZFP580的序列设计引物，预测产物长度273 bp。引物序列如下：p1：5′ATTAGATCTATGCTGCTGCTGCCGCCGC3′；p2：5′ATAACTCGAGTCAGTGCAGGCGCACGTGC3′。内参照βactin（540 bp）上游引物5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′；下游引物5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′。

　　1.4.2 逆转录合成cDNA

　　按逆转录试剂恍说明操作，每20 μl反应体系内含有2 μl 25 mmol/L MgCl2，2.2 μl 10× 逆转录缓冲液，2 μl 10 mmol/L dNTP混合物，0.5 μl RNA酶抑制剂，15 U AMV逆转录酶，0.5 μg Oligo(dT)引物，2.0 μg RNA模板。以上试剂混合后于42℃反应60 min，然后于99℃加热5 min，灭活酶活性。立即置冰水浴10 min。

　　1.4.3 PCR产物电泳

　　用上述逆转录cDNA为模板扩增ZFP580，每50 μl反应体系内含10×PCR 缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCl2 2 μl，10 mmol/L dNTP 混合物2 μl，Taq DNA 聚合酶0.5 μl(2.5 U)，40 pmol/L 引物，逆转录产物2 μl，PCR反应条件如下：94℃ 3 min;30×(94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 1 min);72℃ 10 min 。每批模板均同时进行βactin mRNA的扩增作为内参照，PCR反应扩增条件如下：94℃ 3 min；30×(94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃ 1 min)；72℃ 10 min。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳并分析。

　　1.5 统计学处理

　　采用SPSS11.0统计软件进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 成功构建去势C57BL/6小鼠高脂血症模型

　　测定假手术组、去势对照组、去势实验组血脂。各组小鼠血脂测定见表1，假手术组和实验组血脂测定结果比较无统计学意义（P>0.05），假手术组和对照组，对照组和实验组血脂测定结果比较有统计学意义（P<0.05）。三组小鼠血脂均不同程度升高，其中对照组总胆固醇和低密度脂蛋白升高最为明显，验证了去势C57BL/6高脂血症小鼠模型的构建成功。表1 各组小鼠血脂测定结果（略）

　　2.2 ZFP580基因的RTPCR结果

　　对所提总RNA进行逆转录和半定量PCR分析，于1.5%琼脂糖凝胶中电泳（图1），并对电泳图像分析处理，假手术组(1.24±0.14)和实验组ZFP580基因表达水平(1.21±0.11)无统计学差异（P>0.05），假手术组和去势对照组(1.02±0.09)，去势实验组和去势对照组ZFP580基因表达水平则有统计学差异（P<0.05）。

　　3 讨 论

　　研究表明，绝经后妇女经雌激素治疗能减少心血管疾病的危险性〔8〕。雌激素能影响多种调节脂代谢的酶，如脂蛋白酯酶和激素敏感酯酶等，也能影响载脂蛋白的合成。体外实验证实雌激素有避免血浆中低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白氧化修饰作用〔9〕。有关雌激素的抗AS作用已经有较多的报道，但其细胞和分子机制目前仍不清楚。

　　ZNF580是一种低密度脂蛋白诱导下调的新基因〔3〕。GenBank的GEO数据库资料表明，雌激素、ET等物质均可不同程度的影响与其结构完全一致的小鼠源性同源基因ZFP580的表达。但目前所了解的ZFP580基因的功能信息还远远不够，此基因的调控因素及其与AS具体关系的阐明有助于在AS的平台上了解ZFP580的功能。

　　本研究结果提示雌激素对高脂血症的形成有一定保护作用。且初步证明雌激素能够上调ZFP580基因的表达。但雌激素如何上调此基因的表达，还需进一步研究。

　　本研究首次探讨了在去势C57BL/6小鼠高脂血症模型上雌激素与AS相关新基因ZFP580的关系，为进一步阐明人ZNF580及其同源性鼠ZFP580基因在AS的发生发展中的作用提供了新的科学依据。

参考文献

　　1 杨永宗.中国动脉粥样硬化病理生理学研究近况〔J〕.中国动脉硬化杂志，2004；12（4）：4819.

　　2 费震宇，王文健，关 明，等.雌激素对去势高脂血症兔血脂及氧化型低密度脂蛋白mRNA表达作用的实验研究〔J〕.上海医学，2004；27（4）：2413.

　　3 张文成，陈保生，曾武威，等.低密度脂蛋白诱导下调的新基因cDNA的克隆及组织表达〔J〕.基础医学与临床，2003；23(3)：27982.

　　4 Zhang WCH，Zhang M，Xu RCh，et al.Zinc finger protein ZNF580locates at MGC803 nucleus〔J〕.Basic Clin Med，2006；26(2)：199200.

　　5 张文成，孙慧燕，罗玉玉，等.ZNF580与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HEK293细胞的表达和定位〔J〕.武警医学院学报，2008；17(3)：1615.

　　6 The RIKEN Genome Exploration Research Group Phase Ⅱ Team and the FANTOM Consortium.Functional annotation of a fulllength mouse cDNA collection〔J〕.Nature，2001；409(6821)：68590.

　　7 孙慧燕，孟祥艳，孔麟麟，等.C57BL/6小鼠ZFP580 C端编码基因的克隆及序列分析位〔J〕.武警医学院学报，2008；17（12）：103740.

　　8 KovacevZavisic B，Icin T，Kovacev B.Hormone replacement therapy and cardiovascular risk in postmenopausal women〔J〕.Med Pregl，2009；62(suppl 3)：8590.

　　9 Martin C，Barturen K，Martinez R，et al.In vitro inhibition by estrogen of oxidative modification of human lipoproteins〔J〕.J Physiol Biochem，1998；54（4）：195202.