嘌呤核苷酸对海洛因处理过大鼠C6神经胶质瘤细胞增殖的影响

　　　　　　作者：李鸿梅 李昆 何海涛 刘剑凯 洪敏

【摘要】 　　目的 探讨海洛因及嘌呤核苷酸对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖的影响。方法 体外培养大鼠 C6 神经胶质瘤细胞，分别以不同浓度的海洛因及嘌呤核苷酸处理细胞，MTT 比色法检测海洛因和嘌呤核苷酸对细胞增殖的影响。 结果 MTT 实验表明，海洛因对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖有抑制作用，120 mg/L海洛因作用 24 h对 C6 细胞的抑制率达 52%，并表现为剂量依赖性；嘌呤核苷酸对 C6 细胞的增殖有促进作用，120 mg/L嘌呤核苷酸作用 24 h，细胞增殖率为 30%，并表现为剂量依赖性。结论 海洛因抑制大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖；嘌呤核苷酸促进大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖，并在某种程度上对抗海洛因对 C6 细胞增殖的抑制作用。

【关键词】 嘌呤核苷酸；海洛因；神经胶质瘤细胞；细胞增殖。

　　【Abstract】Objective To investigate the effects of heroin and purine nucleotides on the proliferation of C6 glioma cells. Methods The effects of heroin and purine nucleotides on the proliferation of C6 glioma cells were evaluated by MTT assay. Results Heroin inhibited the growth of C6 glioma cells in vitro，52% C6 glioma cells were inhibited when the cells were treated with 120 mg/L heroin for 24 h；purine nucleotides promoted the proliferation of C6 glioma cells，30% C6 glioma cells were promoted when the cells were treated with 120 mg /L purine nucleotides for 24 h. Conclusions Heroin inhibits the proliferation of C6 glioma cells，purine nucleotides promotes the proliferation of C6 glioma cells.

　　【Key words】Purine nucleotides；Heroin；Glioma cells；Proliferation

　　由于大鼠 C6 神经胶质瘤细胞膜上存在阿片受体，目前已被广泛用作研究各种阿片类药物作用机制的模型系统〔1，2〕。本实验室研究发现，海洛因不但能够抑制大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖，而且还能使细胞内嘌呤核苷酸分解代谢增强〔3，4〕。已经明确的是海洛因对 C6 神经胶质瘤细胞的增殖有抑制作用，但是嘌呤核苷酸对经过海洛因处理过的大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖是否有影响并未见报道。本实验在前期研究发现的基础上，以大鼠 C6 神经胶质瘤细胞作为靶细胞，研究嘌呤核苷酸对海洛因处理的大鼠C6 神经胶质瘤细胞增殖的影响，探索嘌呤核苷酸治疗阿片类成瘾的潜在机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料和仪器

　　C6 细胞株购自上海细胞研究所。低温台式离心机购自上海化工机械厂。倒置显微镜购自上海蔡康光学仪器有限公司。CO2培养箱购自日本 SANYO 公司。超净工作台购自苏州尚田洁净技术有限公司。DMEM培养基购自 Gibco公司，新生牛血清购自天津血液研究所。噻唑蓝 (MTT)、一磷酸腺苷 AMP 和一磷酸鸟苷 GMP购自Sigma公司。海洛因 (纯度为99% ) 由吉林省公安厅提供，临用时用灭菌三蒸水溶解。

　　1.2 大鼠 C6 神经胶质瘤细胞培养

　　C6 为贴壁生长的细胞。培养基为 DMEM，每100 ml培养基含青霉素 1 万U，链霉素10 mg，新生牛血清 15 ml，用灭菌的 5.6% NaHCO3 溶液调 pH7.2，置于 CO2 孵箱，37℃、5% CO2 条件下培养。细胞生长至近融合状态时，用 0.25% 胰酶消化传代，每周2～3次。

　　1.3 MTT 比色法检测海洛因对

　　C6 细胞增殖的影响及最佳药物剂量筛选 将处于对数生长期的细胞，用0.25%胰酶消化，用吸管将细胞吹打成单细胞悬液，血细胞计数板计数；将细胞以 1×104个/cm2 的浓度接种到 96 孔细胞培养板中，每组均设 3 个平行孔。以生理盐水作对照，加入海洛因使其终浓度分别为10、40、80 和 120 mg/L，37℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h 后加入 20 μl浓度为 5 g/L的MTT，培养箱中继续培养 4 h；弃培养基，每孔加入 DMSO 200 μl，室温振荡 10 min 后，用酶标仪在波长 490 nm处测定吸光度值，计算细胞的生存率 (%) = (各实验组 OD 值/对照组 OD 值)×100%，绘制细胞生长曲线。

　　1.4 MTT 比色法测定嘌呤核苷酸对海洛因处理细胞增殖的影响

　　将处于对数生长期的细胞用0.25%胰酶消化，用吸管将细胞吹打成单细胞悬液，血球计数板计数；将细胞以1×104个/cm2的浓度接种到96孔细胞培养板中，每组均设3个平行孔。对照组为海洛因处理组，加入海洛因使其终浓度为120 mg/L；嘌呤核苷酸处理组在加入120 mg/L海洛因的同时，加入等摩尔混合的嘌呤核苷酸，使嘌呤核苷酸终浓度分别为10、40、80和120 mg/L，37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后加入20 μl浓度为 5 g/L 的MTT，培养箱中继续培养4 h；每孔加入 DMSO 200 μl，室温振荡10 min 后，用酶标仪在波长 490 nm处测定吸光度值，计算细胞生存率(%)=(各实验组OD值/对照组OD值)×100%，绘制细胞生长曲线。

　　1.5 统计学分析

　　用SPSS 13.0 统计分析软件进行方差齐性检验及成组设计资料 t检验。

　　2 结 果

　　2.1 海洛因对C6 细胞增殖的影响及最佳药物浓度

　　MTT 实验发现，低剂量 (10 mg/L) 的海洛因对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖的抑制作用并不明显，490 nm处吸光度值为1.393±0.084，其抑制率仅为 7%，与对照组(1.497±0.091)比较差异不显著 (P＞0.05)。当海洛因的浓度达到40 mg/L时，490 nm处吸光度值为0.967±0.097，对 C6 神经胶质瘤细胞增殖的抑制率为 35%；海洛因浓度为 80 mg/L 时，490 nm处吸光度值为0.777±0.067，抑制率为 48%；海洛因浓度为 120 mg/L 时，490 nm处吸光度值为0.713±0.068，抑制率为 52%；与对照组比较，差异均有显著性 (P＜0.05)。因此本文选择 120 mg/L的海洛因作为最佳药物剂量。

　　2.2 嘌呤核苷酸对海洛因处理的 C6 细胞增殖的影响

　　海洛因对照组490 nm处OD值为0.847±0.081，与海洛因组比较，嘌呤核苷酸的浓度为 10和 40 mg/L 时，490 nm处OD值分别为(0.573±0.077，0.803±0.098)，对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖的作用并不明显 (P＞0.05)。嘌呤核苷酸的浓度达到80 mg/L时，490 nm处OD值为1.037±0.059，细胞增殖率为 22%；嘌呤核苷酸的浓度为 120 mg/L时，490 nm处OD值为1.097±0.114，细胞增殖率为 30%；与海洛因组比较，差异均有显著性 (P＜0.05)。

　　3 讨 论

　　研究发现，海洛因能够抑制体外培养的大鼠神经元细胞增殖，其机制是海洛因诱导神经元细胞凋亡〔5〕。阿片类药物吗啡对去甲基丙咪嗪 (抗抑郁药) 和内皮素等药物处理后的大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖有抑制作用〔6〕。除此之外，本研究还发现，吗啡对没有经过任何药物处理的大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖也有抑制作用〔7〕。海洛因抑制大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖，其机制是海洛因使大鼠 C6 神经胶质瘤细胞中增殖细胞核抗原(PCNA) 表达减少 〔3，4〕。本实验通过 MTT 比色法也证实了海洛因浓度达到 40 mg/L 时，以剂量依赖的方式抑制大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖。同时，本实验通过 MTT 比色法证明，嘌呤核苷酸的浓度达到 80 mg/L时，以剂量依赖的方式促进大鼠 C6 神经胶质瘤细胞的增殖。这一结果表明，嘌呤核苷酸能够对抗海洛因对大鼠 C6 神经胶质瘤细胞增殖的抑制作用，其机制有待进一步探讨。

参考文献

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　　3 迟秀梅，张纪周，阚慕杰，等.海洛因对 C6 细胞增殖细胞核抗原基因表达的影响〔J〕.吉林大学学报（医学版），2008；34(6)：94951.

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　　6 Bohn LM，Belcheva MM，Coscia CJ.Muopioid agonist inhibition of kappaopioid receptorstimulated extracellular signalregulated kinase phosphorylation is dynamicdependent in C6 glioma cells〔J〕.J Neurochem，2000；74(2)：57481.

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