氯离子通道阻滞剂对人眼小梁细胞增殖的影响

　　　　　　 作者：丁会 王建国 李丹 刘伟 李志超

【摘要】 目的 探讨氯离子通道阻滞剂5硝基2(3苯丙胺)苯甲酸〔5nitro2(3phenylpropylamino)benzoic acid，NPPB〕对体外培养人眼小梁细胞增殖的影响。方法 RTPCR检测体外培养人眼小梁细胞ClC3 mRNA表达，用不同浓度的NPPB作用体外培养的人眼小梁细胞，台盼蓝染色细胞计数法检测细胞存活率，四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测其增殖能力。结果 体外培养人眼小梁细胞存在ClC3 mRNA表达；不同浓度NPPB作用后小梁细胞存活率无显著差异；在一定浓度范围内（50～100 μmol/L），NPPB均可使体外培养的人眼小梁细胞增殖能力下降，其中100 μmol/L NPPB的作用最强。结结论 一定浓度的NPPB可降低体外培养的人眼小梁细胞增殖能力。

【关键词】 5硝基2(3苯丙胺)苯甲酸（NPPB）；小梁细胞；青光眼；RTPCR；MTT法

　　【Abstract】Objective To research the effect of chloride channel inhibitor 〔5nitro2(3phenylpropylamino)benzoic acid，NPPB〕on cultured human trabecular meshwork cells in vitro.Methods The mRNA expression of ClC3 in cultured human trabecular meshwork cells was detected in vitro with RTPCR.The cultured human trabecular meshwork cells in vitro were treated with different density of NPPB to detect the cell survival rate with trypan blue stain and cytometry，and to measure the cell proliferation with MTT.Results ClC3 mRNA expressed in cultured human trabecular meshwork cells in vitro.During the density from 50～100 μmol/L，the cell survival rate had no significant difference，but the cell proliferation decreased.100 μmol/L NPPB had the most effect.Conclusions The cell proliferation of trabecular meshwork cells could be reduced by certain concentration of NPPB.
　　
　　【Key words】 NPPB；Trabecular meshwork cell；Glaucoma；RTPCR；MTT

　　老年人群中青光眼是仅次于白内障的第二大致盲眼病，我国50岁以上城镇居民中青光眼的患病率高达3.8%〔1〕。目前关于青光眼发病机制的研究大多集中在小梁细胞结构及生物学特征的变化上，而大量研究发现氯离子通道与细胞的增殖分化密切相关，本试验用不同浓度氯离子通道阻滞剂5硝基2(3苯丙胺)苯甲酸〔5nitro2(3phenylpropylamino)benzoic acid，NPPB〕作用于体外培养的人眼小梁细胞，观察其对细胞增殖的影响，以探讨氯离子通道在小梁细胞增殖中的作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 人眼小梁细胞的体外培养

　　永生株人眼小梁细胞（中山大学眼科中心卓业鸿教授馈赠），采用15%胎牛血清DMEM F12培养液，37℃培养箱中培养，每2～3天换液1次，细胞长满后，加入0.25%胰酶消化传代，传至第3～4代细胞均匀一致，融合后数量恒定，进行实验。

　　1.2 RTPCR检测人眼小梁细胞上ClC3 mRNA表达

　　取体外培养的永生株人眼小梁细胞，提取总RNA（步骤参照试剂盒），以RNA为模板，以逆转录方式获得cDNA，反应产物行PCR扩增。上游引物：5′GGGGTTTCTGTAGCTTTTGGTG3′；下游引物：5′CCACTGTCATATTGTCCTGTGTCAG3′，扩增条件：94℃预变性5 min，再进行30个循环，每个循环包括：94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸10 min，冷却到4℃。最后琼脂糖凝胶电泳观察。

　　1.3 MTT法检测小梁细胞增殖率

　　实验分为对照组和不同浓度NPPB组，取对数生长期永生株人眼小梁细胞细胞，经0.25%的胰蛋白酶消化，用含15%胎牛血清的DMEM 培养液配成单个细胞悬液，以2.5×108 ml-1的密度接种于96 孔培养板中，每孔100 μl，37℃，5%CO2培养箱中培养。次日分别加入不同浓度NPPB（10、50、100 μmol/L），待加入后48 h检测，检测前4 h 每孔加入MTT溶液20 μl，继续培养4 h，弃去培养液，用无血清培养液漂吸1次，加入MTT 裂解液（20% SDS，50%DMSO）100 μl，孵育箱孵育8 h后，微量振荡器振荡5 min，待紫色结晶完全溶解后，用酶标测试仪测定A 值，测定波长为570 nm，参考波长为630 nm。增殖率=处理组A值/对照组A值×100%。取3孔的平均值，每组重复3 次。

　　1.4 台盼蓝染色细胞计数检测小梁细胞存活率

　　实验分为对照组（DMSO）和不同浓度NPPB实验组（10、50、100 μmol/L），NPPB作用48 h后用0.08％台盼蓝进行染色，细胞计数监测细胞存活力。细胞存活率=(细胞总数-着染细胞数)/细胞总数×100%。每组重复3次，取平均值。

　　1.5 统计学处理

　　数据用x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件进行组间单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 RTPCR结果

　　体外培养的永生株人眼小梁细胞，电泳结果显示有一条特异性条带，位置为1 072 bp，表明在人眼小梁细胞上有ClC3 mRNA的表达（图1）。

　　2.2 MTT法检测NPPB对小梁细胞增殖率的影响

　　10、50、100 μmol/L的NPPB作用于小梁细胞后，均低于对照组吸光度值（0.328±0.021），分别为0.320±0.032、0.238±0.012、0.150±0.012。

　　2.3 不同浓度的NPPB孵育48 h后各组小梁细胞增殖率比较
　　10 μmol/L NPPB对小梁的增殖无明显作用，而50 μmol/L的NPPB对小梁细胞增殖有明显抑制作用（抑制率约20％，P<0.05）。随着浓度的增加，抑制作用增强，100 μmol/L的NPPB对小梁细胞的增殖大约抑制50％～60％（P<0.01）；说明氯离子通道阻滞剂NPPB浓度依赖性地抑制小梁细胞增殖。

　　2.4 台盼蓝染色细胞计数检测NPPB对小梁细胞存活率的影响

　　各浓度NPPB作用后小梁细胞存活率无显著差异（P>0.05）（表1）表1 不同浓度NPPB作用后小梁细胞存活率（略）

　　3 讨 论
　　
　　青光眼是主要的不可逆性致盲眼病之一，其中高眼压是青光眼性视神经损伤的主要危险因素。眼压升高的原因是房水的外流阻力增高，其病理部位已锁定小梁网。而小梁细胞作为小梁网的内皮细胞，其形态和功能的异常将引起房水外流受阻。ClC氯离子通道在哺乳动物细胞中被广泛表达，国外研究〔2〕发现人眼小梁细胞上存在ClC1～7的表达，本实验通过RTPCR方法检测到ClC3在永生株人眼小梁细胞上的表达，与国外研究相符。氯离子通道在细胞迁移、细胞容积的调节、免疫应答反应以及细胞内pH值的调整等方面都发挥作用〔3〕，随着研究的深入，逐步发现ClC氯离子通道与细胞的增殖分化也存在密切关系〔4〕。
　　
　　氯离子通道阻滞剂NPPB属芳香族酸类容量敏感性氯通道阻滞剂，微摩尔量级剂量即可产生抑制作用，作用部位可能在通道外嘴，与膜脂作用而改变通道蛋白的构象，从而阻断氯通道〔5〕。目前发现它对ClC3等多种氯离子通道均有阻断作用。MTT法〔6〕是观察细胞增殖的较为理想的指标，本实验说明氯离子通道阻滞剂NPPB浓度依赖性地抑制了人眼小梁细胞的增殖，而不影响细胞的存活率，但这种抑制作用的机制尚不完全清楚。Voets 等〔7〕报道氯通道阻断剂能抑制牛肺动脉内皮细胞的增殖，抑制容积调节性氯通道，他们认为由于细胞肿胀，激活的容积调节性氯通道与依赖细胞周期的蛋白激酶相互作用，影响细胞增殖;另外，可能是因为容积和pH值变化对细胞增殖产生影响〔8〕。NPPB对小梁细胞增殖的抑制作用是否与小梁细胞的细胞周期改变有关，还有待于进一步研究。
　　

参考文献

　　1 葛坚.我国近五年青光眼临床与基础研究进展〔J〕.中华眼科杂志，2005；41(8):7106.

　　2 Comes N，Gasull X，Gual A，et al.Differential expression of the human chloride channel genes in the trabecular meshwork under stress conditions〔J〕.Exper Eye Res，2005；80：80113.

　　3 Jatinder Ahluwalia.Chloride channels activated by swell can regulate the NADPH oxidase generated membrane depolarisation in activated human neutrophils〔J〕.Biochem Biophys Res Commu，2008；365(2)：32833.

　　4 Comes N，Abad E，Morales M，et al.Identification and functional characterization of ClC2 chloride channels in trabecular meshwork cells〔J〕. Exper Eye Res，2006；83:87789.

　　5 Zhang GP，Shi Y.Progress in the study of back ground chloride channels〔J〕.Prog Biochem Biophys，1998；25(4)：3248.

　　6 Abate G，Mshana RN，Miorner H.Evaluation of a colorimetric assay based on 3(4，5dimet ylthiazol2yl)2，5diphenyl tetrazolium bromide (MTT) for rapid detection of rifampicin resistance in mycobacterium tuberculosis〔J〕.Int J Tuberc Lung Dis，1998；2(12)：10116.

　　7 Voets T，Szucs G，Droogmans G，et al.Blockers of volumeactivated Clcurrents inhibit endothelial cell proliferation〔J〕.Pflugers Arch，1995；431(1):1324.

　　8 钟宁，方奇志，金满文，等.血管内皮细胞容量激活的氯通道〔J〕.生命科学，2000;12(3)：1225.