血管紧张素原基因两个多态位点与海南地区汉族脑梗死的关系

　　　　　　 作者：张勇 金水晶 周代锋 张云霞

　　　　陈少华 李林江 王镇 吴恳 习隽丽 陈照清

【摘要】 　　目的 了解血管紧张素原（AGT）基因T174M和M235T的多态性与海南地区汉族脑梗死的关系。方法 应用等位基因特异性PCR技术，对334例海南地区汉族脑梗死患者和193例海南地区汉族正常对照组中AGT基因T174M、M235T多态位点进行检测，统计各组基因型频率及各组等位基因频率。结果 T174M基因多态性和M235T基因的T等位基因频率增高在脑梗死组与正常对照组间有显著性差异（χ2=6.608，P＜0.05;χ2=4.314，P＜0.05）；而M235T基因多态性和T174M基因的T等位基因频率在两组间无显著性差异（χ2=44.080，P>0.1；χ2=3.873，P>0.05）。结论 AGT基因T174M多态性及M235T基因的T等位基因频率增高与海南汉族脑梗死发病相关，而M235T基因多态性及T174M基因的T等位基因频率与脑梗死无关。

【关键词】 血管紧张素原基因；DNA多态性；脑梗死；汉族

　　脑梗死是一类严重危害人类健康的常见病，受遗传和/或环境因素影响，遗传因素可能更重要。在遗传因素的研究中，肾素血管紧张素醛固酮（RASS）系统在心脑血管病的发病相关性研究较受重视，认为血管紧张素醛固酮可以影响血管平滑肌及血管内皮细胞功能，是造成动脉粥样硬化及血栓形成的主因之一。本研究旨在了解海南地区血管紧张素原（AGT）基因T174M、M235T多态性与脑梗死发病的相关性。

　　1 资料与方法

　　1.1 对象

　　所有入选者均为2007至2009年我院健康体检者及住院的脑梗死患者。正常对照组193例，其中男性118例，女性75例，年龄51～75岁，平均(63.94±10.76)岁，均排除冠心病、高血压、脑梗死、糖尿病等；脑梗死组334例，其中男性225例，女性109例，年龄52～78岁，平均(65.11±11.18)岁。脑梗死的诊断均经头颅CT和/或MRI证实。抽取入选者静脉血3 ml，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，按Lahiri等〔1〕方法提取DNA。同时检测其血脂、载脂蛋白、血压及颈动脉硬化状况等指标。

　　1.2 等位基因特异性PCR扩增AGT基因

　　1.2.1 引物的设计与合成

　　从GenBank中获得人类AGT基因的DNA全序列和mRNA序列，用PCR DESN软件辅助设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，见表1。表1 等位基因特异性PCR的引物序列及扩增片段长度（略）

　　1.2.2 PCR扩增

　　每个多态位点均设立2个PCR检测管，分别加入寡核苷酸正常和突变引物用于检测每个多态位点正常和突变的等位基因。反应体系如下：每管在1×PCR缓冲液（10 mmol/L TrisHCl，pH 8.3，50 mmol/L KCl，1.5～2.0 mmol/L MgCl2）中含模板DNA 0.2 μg，引物各0.2～0.5 μmol/L，4种dNTP各200 μmol/L，Taq DNA聚合酶（北京天根公司产品）1 U。PCR循环参数：首先94℃热变性2 min，随后进行32个循环（每个循环包括94℃ 50 s，60℃ 50 s，72℃ 60 s）。扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色在UVI band凝胶成像系统（英国UVI tec 公司）中观察结果并照相。
　　
　　每种AGT基因多态位点都利用突变型引物和野生型引物同时进行两管PCR扩增。若只有正常引物能扩增，则提示无相应突变；若只有突变引物扩增，则提示受检标本为突变的纯合子；若正常与突变引物都能扩增，则提示受检标本为突变的杂合子。根据每个样品两种等位基因扩增产物结果，可准确判定样品的基因类型。此外，在全部PCR反应中同时扩增了AGT基因的一个584 bp片段作为内参照来判断样品DNA的完整性和PCR的质量。

　　1.3 统计学方法

　　应用SPSS13.0统计分析软件包进行分析。数据采用x±s表示。计数资料的组间比较采用t检验，率的比较采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 用等位基因特异性PCR扩增两种AGT基因多态位点的基因分型结果 见图1。

　　2.2 海南地区汉族脑梗死组和正常对照组中AGT基因两种多态位点的频率 见表2，表3。表2 海南地区汉族脑梗死组和正常对照组中AGT基因两种多态位点的等位基因频率(略)表3 海南地区汉族脑梗死组和正常对照组中AGT基因两种多态位点基因型的频率分布〔n(略)〕

　　3 讨 论

　　近来显示，干预RAS功能的血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（AGTR）可以降低脑梗死的发病率和病死率，因为RAS系统中ACE和AGT水平可影响脑局部相关受体激动，造成局部脑血管平滑肌细胞增生和细胞外基质增加及内皮细胞功能障碍，因而发生脑梗死。

　　Jeunemaitre等〔2〕认为携带235T等位基因者血浆AGT浓度较不携带者高10%～20%。Sethi等〔3〕发现235TT伴174TT纯合子较235MM和174TT纯合子的血浆AGT浓度上升10%。由于血浆AGT浓度是AngⅡ形成的限速因子，故目前对AGT基因T174M、M235T突变基因多态性与脑梗死的相关性研究成为热点。但在各种研究中，却有截然不同的结论。有些研究认为两者都与脑梗死相关，有些研究认为M235T与脑梗死相关，而也有研究认为T174M与脑梗死有关，甚至两者均与脑梗死无关〔4-7〕。造成多种结果的原因考虑与不同种族或民族及地理环境、人文环境等有关。

　　本研究发现，海南地区汉族脑梗死与T174M基因多态性相关，与T等位基因频率无关；而海南地区汉族脑梗死与M235T多态性无关，却与T等位基因频率相关。这可能提示海南地区汉族有脑梗死高危因素，对其进行T174M及M235T基因多态性检测，对于防治脑梗死可能有益。但由于脑梗死是多基因及多种环境因素共同作用的结果，仅分析个别基因不能客观反映其与脑梗死的关系，应选择更多个候选基因从不同侧面进行客观分析，以了解不同基因之间的相互作用对脑梗死的影响。故仍有必要进行多中心、大样本的临床研究，为脑梗死的一级预防提供新的依据。

参考文献

　　1 Lahiri DK，Schnabel B.DNA isolation by a rapid method from human blood samples:effects of MgCl2，EDTA，storage time，and temperature on DNA yield and quality〔J〕.Biochem Genet，1993；31(78):3218.

　　2 Jeunemaitre X，Soubrier F，Kotelevtsev YV，et al.Molecular basis of human hypertension：role of angiotensinogen〔J〕.Cell，1992；71（1）:16980.

　　3 Sethi AA，Nordestgaard BG，AgerholmLarsen B，et al.Angiotensinogen polymorphisms and elevated blood pressure in the general population：the Copenhagen city heart study〔J〕.Hypertension，2001；37（3）：87581.

　　4 张颖冬，葛剑青，石静萍，等.血管紧张素原及其基因多态性与缺血性脑血管病的相关性研究〔J〕.中国临床神经科学，2004；12（3）:2303.

　　5 管立学，张爱娟，肖守仁，等.血管紧张素原基因CD235Met→Thr变异与脑梗塞发病的关系〔J〕.中华医学遗传学杂志，2000；17(5):3369.

　　6 牛小媛，琚小红，解龙昌，等.血管紧张素原基因M235T多态性与中青年脑梗死的关系〔J〕.中国神经精神疾病杂志，2006；32(4):36970.

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