生理剂量睾酮通过雄激素受体改善小鼠行为学能力的研究

　　　　 作者：洪雷 吴赛珠 郑华 周忠江 邢晓雯 张莉

【摘要】 　　目的 探讨生理剂量的雄激素对小鼠行为学的影响及其机制。方法 29只4 w龄的C57BL/6J雄鼠分为正常组、去势组、去势+丙酸睾酮（TP）组，16只4 w龄的不表达有活性雄激素受体（AR）的睾丸女性化（tfm）雄鼠分为tfm组、tfm+TP组，造模3个月后对各组小鼠进行自主活动能力、避暗穿梭实验和水迷宫实验测定，最后由Nissl染色观测海马区的细胞形态学变化。结果 各项行为学检测及大脑海马区Nissl染色结果均一致，正常组、去势+TP组小鼠的各项指标结果皆显著优于去势组、tfm组和tfm+TP组小鼠，而去势组、tfm组和tfm+TP组之间未见统计学差异。结论 雄激素通过AR途径维持大脑海马区的正常形态来改善小鼠的自主活动能力、学习记忆能力。

【关键词】 丙酸睾酮；雄激素受体；行为学；睾丸女性化小鼠

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of physiological doses of testosterone on the ability of mouse behavior. Methods 29 4weekold C57BL / 6J male mice were pided into normal， castrated， castrated + testosterone propionate (T) groups randomly， 16 testicular feminizated (tfm) male mice which expressed nonfunctional androgen receptor(AR) were pided into tfm， tfm + T groups randomly. After 3 months of treatment， the behaviors of mice were measured by spontaneous motors， stepthrough and watermaze tests. The structure and the number of neurons of hippocampus were detected by Nissl strain. Results All the behavior tests showed that， the results of all the indicators of normal group and castrated + T group were better than the results of castrated group， tfm group and tfm + T groups. But there were no statistically difference among castrated group， tfm + T group and tfm + T group. Conclusions Testosterone can increase the spontaneous motors activity， improve the learning and memory abilities of mice， but these effects can not be observed when the AR is blocked. And other nonAR pathways of testosterone seems no effect on the ability of mouse behavior.

　　【Key words】 Testosterone propionate; Adrogen receptor；Behavior；Testicular feminizated mouse

　　阿尔茨海默病（AD）是一种与年龄相关的神经退行性疾病，以进行性记忆力减退和认知功能障碍为主。AD患者学习、记忆能力的减退与雌、雄激素水平下降均存在显著的关联〔1～3〕。大脑内广泛分布着雄激素受体（AR）〔4〕，AR参与了雄激素对大脑的生理效应。而在雄激素对自主活动能力、记忆学习能力等行为学的影响中，AR途径和众多的非AR发挥着何种作用尚需进一步研究。睾丸女性化（tfm）小鼠由于点突变而导致不能表达有活性的AR，是一种研究经典AR功能的理想的动物模型〔5〕。本文采用tfm小鼠观察在缺乏经典AR途径的情况下雄激素通过其他非AR代谢途径对小鼠行为学的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物

　　4周龄健康SPF级雄性C57BL/6J小鼠29只，由南方医科大学动物实验中心提供；4周龄健康SPF级tfm雌鼠16只，购自Jackson实验室，体重20～23 g，在SPF级环境中与雄性C57BL/6J小鼠繁殖，鉴定后代中的tfm小鼠用于实验。所有小鼠自由饮水进食，昼夜时间比为14 h/10 h。

　　1.1.2 药品及试剂

　　丙酸睾酮（Testosterone Propionate，TP）由广州明兴制药厂提供（批号：070701），睾酮ELISA检测试剂盒由R&D公司提供，DNA提取试剂盒由上海申能博彩生物科技有限公司提供。

　　1.1.3 仪器

　　ZZ6小鼠自主活动测试仪、BA200小鼠避暗仪为成都泰盟科技有限公司产品，SMG2型水迷宫程序自动控制仪为中国医学科学院药研所产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 由性别PCR筛选tfm小鼠

　　繁殖出的小鼠达到4周龄时，挑选外生殖器为雌鼠表现者，表皮消毒后剪取长约0.5 cm的末端尾巴，根据DNA试剂盒说明书操作提取总DNA。通过性别PCR来检测小鼠是否表达Y染色体，由此判定小鼠性别，性别引物上游序列为：5′ACTTGTCTTGCCATTCTGTT3′，下游序列为：5′CTCCCATCCTTCTAATCTGT3′，目的片段为207 bp。PCR产物电泳出现条带者，提示为外生殖器为雌鼠表现并表达Y染色体的小鼠，可认为是tfm小鼠。

　　tfm小鼠的验证，扩增上述tfm小鼠AR的DNA片段，AR上游引物为：5′CTTTCAAGGGAGGTTACGC3′，下游引物为：5′CCAGGAAGAAGAGGTGGTG3′，目的片段为373 bp。另取正常C57BL/6J雄鼠作为阳性对照。将每个AR的PCR产物进行基因序列测定，验证其AR是否发生突变。

　　1.2.2 动物分组

　　C57BL/6J小鼠随机分为3组，即正常组10只、去势组10只、去势+TP组9只；tfm小鼠分为tfm组8只、tfm+TP组8只。

　　去势小鼠经腹腔注射0.1 ml的1%戊巴比妥钠麻醉后，仰卧固定，消毒阴囊及周围皮肤，沿正中线剪开阴囊，夹出双侧睾丸、附睾及睾周脂肪，结扎血管，之后缝合阴囊，手术切口消毒，并连续3 d注射青霉素预防感染。手术后恢复2 w予以药物处理：去势+TP组按1 mg/kg颈背部皮下注射TP（用芝麻油稀释），每3日给药1次〔6，7〕。正常组、去势组、tfm组予以相同剂量的芝麻油，给药3个月。所有行为学检测均在上午9：00～11：30进行。

　　1.2.3 小鼠自主活动能力实验

　　将每只小鼠先置于自主活动记录仪中，熟悉环境5 min后开始记录活动次数，每次5 min，共测2次，连续检测3 d。

　　1.2.4 小鼠避暗穿梭实验

　　参照文献〔7〕，将小鼠背向洞口放入明室，适应3 min后启动计时器。动物穿过洞口进入暗室受到电击，计时器自动停止，记录每只小鼠从放入明室至进入暗室遭电击所需的时间，此即潜伏期，每进入暗室遭电击1次，算1次错误。第1天训练5 min（记忆获得），24 h后重作测验，并记录每只动物的潜伏期和5 min内的错误次数。

　　1.2.5 小鼠水迷宫实验

　　参照文献〔8〕，先按阶段训练小鼠，将小鼠测试时间定为120 s，对120 s内不能完成训练的小鼠引导其游完全程，小鼠每进入1次盲端定为错误1次。之后记录第2、3、4天每只小鼠的游出时间和总错误次数，在120 s内未到达终点的小鼠记为120 s。水迷宫四周为白色墙壁，撤去任何可能作为参照物的物体。

　　1.2.6 血清睾酮测验

　　小鼠在0.15 ml的1.5%戊巴比妥钠麻醉下摘除眼球取血，血液静置30 min后于1 000 r/min离心15 min提取血清，用ELISA试剂盒检测血清睾酮水平。

　　1.2.7 大脑海马细胞尼氏（Nissl）染色

　　将分离的大脑组织固定于甲醛液中。常规脱水、透明、浸蜡、包埋。之后由冠状面做连续切片，间隔50 μl，片厚5 μl，之后脱蜡至水， 1%甲苯胺蓝水溶液染色。每例动物标本取2张切片，于左侧海马CA1区测5个高倍视野（400倍），计数每个视野下神经元细胞，取均值。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS13.0统计软件，所有数据用x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 tfm小鼠鉴定

　　提取每只小鼠总DNA后进行性别PCR，见图1A。泳道1无条带出现，提示为无Y染色体的雌鼠，泳道2、3、4于207 bp处可见明显条带；将图1A 2、3、4样本的DNA及正常C57BL/6J雄鼠的总DNA做AR的PCR于373 bp处可见明显条带，见图1B。将该PCR产物做基因序列测定，见图2A，tfm小鼠AR序列于160位点处出现5个连续的胞嘧啶；正常C57BL/6J雄鼠AR PCR产物则于160位点处可见6个连续的胞嘧啶，见图2B。正是由于这个点突变，造成tfm小鼠不能表达有活性的AR。

　　2.2 小鼠血清睾酮水平

　　与正常组〔(8.71±0.17) ng/ml〕比较，去势组、tfm组小鼠血清睾酮水平〔(1.45±0.08) ng/ml，(2.05±0.11) ng/ml〕均显著下降（均P＜0.001），且tfm组与去势组之间无显著差异（P＞0.05）。在补充外源性睾酮后，去势+TP组〔(9.71±0.29) ng/ml〕、tfm+TP组〔(8.90±0.22) ng/ml〕小鼠血清睾酮水平均恢复到正常组水平（P＞0.05）。

　　2.3 小鼠自主活动结果

　　在小鼠自主活动测试中，正常组的自主活动次数(97.77±9.99)显著高于去势组(59.50±14.40)和tfm组(70.00±22.62)小鼠。去势+TP组小鼠自主活动次数增加(88.33±20.76)，并与正常组无统计学差异（P＞0.05）。而与tfm组比较，tfm+TP组小鼠的自主活动次数(71.13±14.57)并未增加（P＞0.05）。

　　2.4 小鼠避暗穿梭实验结果

　　第1天的避暗穿梭实验中，各组的错误次数无统计学差异，第2天去势组小鼠的错误次数高于其他各组。在第1天避暗穿梭实验的潜伏期中，去势+TP组小鼠的潜伏期时间最短（与其他组比较均P＜0.05），而其他4组小鼠的潜伏期未见差别。在第2天的避暗穿梭实验中，正常组小鼠的潜伏期明显延长（与其他组比较均P＜0.05），而其他各组小鼠潜伏期之间则无统计学差异。见表1。表1 各组小鼠避暗穿梭实验结果(略)

　　2.5 小鼠水迷宫实验结果

　　各组小鼠的水迷宫实验错误次数在第1、2天中均未出现差异，直到第3天，去势组、tfm组小鼠的错误次数显著增多。在各组小鼠的水迷宫游出时间比较中，第1天的测试以去势+TP组小鼠耗时最长（与其他组比较均P＜0.05），第2天测试中各组小鼠的游出时间均较第1天有所减少，但各组间无统计学差异。第3天的测试中，各组小鼠的游出时间进一步缩短，且以正常组的游出时间最少（与其他组比较均P＜0.05），而其他4组之间的游出时间则无统计学差异。见表2。表2 各组小鼠水迷宫实验结果(略)

　　2.6 Nissl染色结果

　　正常组小鼠海马CA1区神经元4～6层，排列整齐、密集，胞体大，细胞数为(109.90±21.86)。去势组小鼠海马CA1区神经元松散，排列紊乱，尼氏体减少，核肿胀，部分细胞核仁消失，胞浆界限不清，细胞间隙大，神经元数量(86.80±20.15)较正常组减少（P＜0.05），Nissl染色变浅。补充生理剂量的睾酮后，去势+TP组小鼠海马CA1区结构好转，神经元排列整齐、密集，细胞数(98.33±19.06)与正常组无统计学差异。而tfm组与tfm+TP组小鼠的海马CA1区神经元细胞排列较松散，细胞间隙增加，细胞数量〔(76.50±17.23)，(78.38±15.22)〕较正常组显著减少（均P＜0.01）。见图3。

　　3 讨 论

　　雄激素可以通过众多途径影响大脑功能，如可以通过大脑局部表达的芳香酶转化为雌激素〔9，10〕发挥效应，可以舒展脑血管、增加脑血流量〔11〕，可以修复受损的神经元〔12〕，也可以影响β淀粉样蛋白（Aβ）前体蛋白、载脂蛋白E（ApoE）的表达〔13，14〕等。大脑组织中AR在雄激素的各种大脑效应中起着重要的作用。在本实验中，去势组和tfm组小鼠睾酮(T)水平显著下降，在补充了雄激素主要形式之一的TP后，体内的睾酮水平均恢复到正常组水平；小鼠自主活动测试结果可知，正常组与去势+TP小鼠的自主活动能力优于去势组、tfm组和tfm+TP组小鼠。tfm+TP组小鼠的自主活动次数不仅低于去势+TP组小鼠，而且与tfm组小鼠无统计学差异。由此可知，失去正常水平的T会损害小鼠的自主活动能力，而在阻断AR途径的情况下，即使恢复了体内正常水平的T，也不能改善其自主活动能力。提示T提高自主活动能力的效应是由AR引导的。

　　本实验表明，第1天的潜伏期时间，除去势+TP组时间最短之外，其他各组的潜伏期无统计学差异；在第2天的潜伏期中，正常组的潜伏期时间明显长于其他4组，而其他4组的潜伏期之间无统计学差异。由此可推测，在对电击疼痛记忆中，正常小鼠的记忆能力是最好的。尽管去势+TP组小鼠在第1天中的表现是最差的，但在第2天的测试中，其潜伏期与除正常组之外的各组间已无统计学差异。故可认为，从成绩的提高幅度来看，去势+TP组小鼠的疼痛记忆时间是优于去势组、tfm组和tfm+TP组小鼠的。而tfm+TP组小鼠潜伏期时间与tfm小鼠无差异，提示没有AR的参与，T不能发挥其改善记忆的能力。经过第1天的训练后，各组游出迷宫的错误次数在第2、3天错误次数是逐渐减少的，且各组间无统计学差异，直到第4天时才出现差别，与正常组比较，去势组和tfm组错误次数较多。从游出时间来看，各组游出时间也是逐日递减的，第2天以去势+TP组小鼠耗时最多，到第4天时，正常组小鼠的游出时间明显少于其他各组，且其他各组间的游出时间无统计学差异。故可知在水迷宫实验反映出的学习记忆能力中，正常组小鼠是最好的，去势+TP组小鼠从第2天的游出时间最长，到第4天时已与去势组、tfm组和tfm+TP相近，故可认为去势+TP组小鼠在学习记忆能力提高幅度上，即学习记忆能力上是优于去势组、tfm组和tfm+TP组小鼠的。小鼠在整个水迷宫测试中，tfm+TP组与tfm组小鼠未见差异。由此得知，睾酮是有助于小鼠学习、记忆能力的，但在AR途径阻断的情况下，这种效应也未观察到。这个结果与避暗穿梭实验结果十分一致。

　　大脑海马区被认为是执行学习记忆能力的主要区域〔15〕。从本研究病理图片可知，无论从神经元结构形态、还是神经元数量来看，正常组、去势+TP组小鼠都优于去势组、tfm组和tfm+TP组小鼠。这与上述三项行为学测试结果是一致的。证明生理水平的T可维持海马CA1区的正常形态。而在失去AR途径后，这种效应也消失。另外这也提示，T对学习记忆能力的改善，是通过维持海马区形态来实现的。

　　综上所述，从C57BL/6J小鼠与tfm小鼠的对比中可知，对于雄鼠而言生理水平的T是有利于小鼠自主活动能力、学习记忆能力的，这一效应由AR介导。但在AR途径阻断的情况下，T的非AR途径效应对自主活动、学习记忆能力无影响。

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