生胃酮对大鼠颈动脉损伤后新生内膜过度增殖的影响

　　　　 作者：宋明宝，于学军，崔馨，陈剑飞，卢来春，赵刚，于世勇，董红梅，黄岚

【摘要】 目的：观察生胃酮对大鼠颈动脉损伤后新生内膜过度增殖的影响。方法：采用组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞，Western blot检测生胃酮对大鼠主动脉平滑肌细胞缝隙连接蛋白43表达的影响。采用球囊损伤建立大鼠颈动脉损伤模型，对照组给予生理盐水2 mL、生胃酮组给予生胃酮3 mg/kg 腹腔注射，1次/d，HE染色观察新生内膜形成情况，免疫荧光染色检测新生内膜中缝隙连接蛋白43的表达，伊文思蓝DAPI双染色以评价新生内膜形成情况。结果：所培养的细胞抗SM αactin免疫荧光染色阳性。50 μmol/L生胃酮处理平滑肌细胞24 h后对缝隙连接蛋白43的表达无影响(0.85±0.06 vs 0.83±0.03，n=3，P>0.05)。球囊损伤大鼠颈动脉14 d后可见血管管腔狭窄、新生内膜增生明显。免疫荧光染色显示形成的新生内膜中缝隙连接蛋白43表达丰富。经生胃酮干预后新生内膜增生明显减轻，新生内膜细胞计数显著低于对照组 (89±28.40 vs 236±15.04，n=5，P<0.01)。结论:缝隙连接在血管损伤后新生内膜形成过程中扮演重要角色，而缝隙连接阻断剂生胃酮能抑制新生内膜过度增生。

【关键词】 新生内膜;血管;缝隙连接;生胃酮;大鼠

　　[Abstract] Objective: To observe the effect of carbenoxolone on neointimal hyperplasia after rat carotid balloon injury. Methods: Rat aortic SMCs (RASMCs) were cultured by explanted rat aortic wall tissue and identified with cell immunofluorescence staining for SMαactin. The expression of Cx43 in RASMCs which were treated with carbenoxolone at a concentration of 50 μmol/L for 24 h was detected with western blot. The model of vascular injury was established with rat carotid balloon injury. And animals were administrated with intraperitoneal injections of carbenoxolone [3 mg/(kg·d)] in the carbenoxolone group or with saline (2 mL/d) in the control group for 2 weeks after carotid balloon injury. After 2 weeks， HE staining and DAPIEvens blue double staining were applied to evaluate the neointimal formation of targeted vessels. And cell immunofluorescence staining was used to detect protein Cx43 expression on targeted vessels. Results: RASCMCs were cultured successfully with positive immunofluorescence staining for SM αactin. In this experiment， we found that carbenoxolone couldnt induce the expression of Cx43 protein in RASMCs (0.85±0.06 vs 0.83±0.03， n=3， P>0.05). Two weeks after carotid balloon injury， carbenoxolone could significantly reduce the neointimal formation and the stenosis of blood vessel lumen. When nuclei number of neointima was used to evaluate the neointimal formation， result suggested that nuclei number of neointima in carbenoxolone group was significantly lower than that in the control group (89±28.40 vs 236±15.04， n=5， P<0.01). The expression of Cx43 protein in neointima was abundant. Conclusions: Gap junctions play a key role in neointimal hyperplasia， and carbenoxolone， a special blocker of gap junction， can inhibit neointimal hyperplasia after rat carotid balloon injury.

　　[Key words] Neointima; Vessel; Gap junction; Carbenoxolone; Rat

　　血管损伤后不良修复反应是血管损伤性疾病如儿童过敏性紫癜、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等的主要病理生理学基础，其中关键环节是血管平滑肌细胞由血管壁中层向内膜迁移并增殖，从而导致新生内膜形成并导致血管狭窄。抑制新生内膜过度增殖是血管损伤性疾病防治的重要策略。

　　缝隙连接是相邻细胞间的膜通道结构，它由细胞膜上的连接子相互衔接而成。每个连接子包含六个相同哑铃形蛋白质亚单位——缝隙连接蛋白(connexin， Cx)、连接子即Cx的六聚体所形成的跨膜蛋白通道[1]。该跨膜通道可允许小的信号分子和离子通过，在维持组织动态平衡、调节细胞生长、发育及分化中具有重要作用[1]。近年来研究发现，Cx在血管损伤性疾病的发生、发展过程中具有重要作用。本研究在大鼠颈动脉损伤模型的基础上探讨缝隙连接特异性阻断剂生胃酮对血管损伤后新生内膜过度增殖的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 试剂 DMEM/F12培养基、胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)及DAPI购于美国Gibco BRL公司;生胃酮及兔抗鼠平滑肌α肌动蛋白(SM αactin)单克隆抗体购于美国Sigma公司;羊抗缝隙连接蛋白43多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司; FITC标记的兔抗山羊IgG抗体购于北京中杉公司。

　　1.1.2 实验动物 SPF级SpragueDawley大鼠，体重150～180 g/只，购于第三军医大学实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK(军)2002029。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定 用颈椎脱臼法处死动物，在无菌条件下取大鼠胸腹主动脉，仔细清除血管外膜及脂肪组织，将血管纵向剖开，用0.01 PBS漂洗干净，用眼科镊刮去血管内膜，放入50 mL培养瓶中，在瓶口用眼科剪剪成约1.5 mm×1.5 mm大小的组织块，用吸管将组织块随机铺于瓶底，放入37 ℃、5%CO2的培养箱中贴壁4 h后加入含20% FBS及双抗的DMEM/F12培养基继续培养。以后每3 d更换培养液1次。采用抗SM αactin免疫荧光染色鉴定血管平滑肌细胞。

　　1.2.2 生胃酮对大鼠血管平滑肌细胞Cx43表达的影响 将培养的大鼠主动脉平滑肌细胞培养3 d后加入生胃酮使其终浓度为50 μmol/L，置37 ℃、5%CO2条件下继续培养24 h。未加18 αGA 预处理的细胞作为对照。收集细胞后经裂解液裂解，离心后取上清液，用Lowry法进行蛋白定量，十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)(11%分离胶、4%浓缩胶)电泳，400 V，上样量70 μL。2 h后硝酸纤维素膜转印2 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，羊抗大鼠Cx43多克隆抗体(1∶1 000)孵育过夜，再与1∶5 000 的HRP 标记的兔抗羊抗体结合(水平振荡摇床1 h)。ECL化学发光系统显影，X线片感光洗片，用凝胶成像分析仪进行蛋白相对定量分析。

　　1.2.3 大鼠颈动脉球囊损伤模型的建立 参照韩雅玲等[2]的方法复制大鼠颈动脉损伤模型。简述如下：SD大鼠，用2%戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔麻醉。取颈部正中切口，颈外静脉注射肝素钠100 U/kg。无菌条件下游离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，暂时阻断颈总动脉近心端及颈外动脉血流，结扎颈内动脉远心端，用眼科剪在结扎点旁距颈内动脉分叉点约3 mm处剪开动脉，将1.5 F的Fogarty球囊导管从切口处插入颈总动脉约1.5 cm，1.5大气压充盈球囊，使球囊刚好能在血管中拉动，在远心端缓慢回拉球囊至颈内、颈外动脉分叉处，重复拉动3次，每次间隔2 min，间隔期球囊处于充盈状态，以使损伤区缺血缺氧。结扎颈内动脉分叉处，常规缝合皮下组织和皮肤。14 d后处死动物，取出病变血管及对侧正常血管，OCT包埋后行冰冻切片，经冷丙酮固定5 min后进行HE染色以观察新生内膜形成情况。

　　1.2.4 血管损伤后形成的新生内膜中Cx43表达的检测 14 d后处死动物。步骤简述如下：(1) PBS漂洗1次;(2)0.3%TritonX100室温下孵育10 min;(3) PBS洗涤5 min×3次;(4) 10%正常兔封闭血清37 ℃孵育20 min;(5) 吸弃封闭血清，滴加羊抗Cx43多克隆抗体(1∶100)稀释，阴性对照组用PBS替代一抗，置于湿盒中4 ℃冰箱过夜;(6)PBS洗涤5 min×3次;(7)滴加FITC标记兔抗羊IgG(用0.3%伊文思蓝按1∶200稀释)，37 ℃孵育60 min;(8)PBS洗涤5 min×3次;(9)荧光倒置显微镜观察照相。

　　1.2.5 生胃酮对血管损伤后新生内膜过度增殖的影响 实验分为对照组及生胃酮组。对照组在球囊损伤后给予生理盐水2 mL 腹腔注射，1次/d。生胃酮组在球囊损伤后给予生胃酮3 mg/kg[3]腹腔注射，1次/d。14 d后处死动物，取出病变血管段，OCT包埋后行冰冻切片，经冷丙酮固定5 min后行伊文思蓝DAPI双染色以评价新生内膜形成情况。步骤简述如下：(1) PBS洗涤2 min×3次;(2) 滴加DAPI工作液于切片上，避光室温下孵育2 min;(3) PBS洗涤2 min×3次;(4) 滴加0.3%伊文思蓝于切片上，避光室温孵育5 min;(5) PBS洗涤2 min×3次;(6) 荧光倒置显微镜观察，分别用绿色荧光和蓝色荧光对同一视野摄像，通过计算机图像分析软件ImagePro plus 5.0叠加后测定内膜的细胞核数量以代表新生内膜形成情况。

　　1.2.6 统计学处理 所有数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 大鼠血管平滑肌的鉴定

　　细胞形态学特征：培养5 d左右可见长梭型细胞自组织块边缘长出，14 d左右可见细胞融合成层并平行排列(图1A)。传代后呈“谷峰”样生长，3 d后可达到60%融合。

　　免疫荧光染色：平滑肌αactin免疫荧光染色呈阳性(图1B)，而阴性对照组则为阴性。进一步说明培养的细胞是血管平滑肌细胞。

　　2.2 生胃酮对大鼠血管平滑肌细胞Cx43表达的影响

　　为了进一步探讨缝隙连接阻断剂作用于大鼠血管平滑肌细胞是通过影响大鼠血管平滑肌细胞Cx43的表达还是通过阻断细胞间的直接通讯来发挥作用，本实验采用western blot来检测Cx43的表达。结果显示：在用缝隙连接阻断剂生胃酮预处理大鼠血管平滑肌细胞24 h后，Cx43表达与对照组比较差异无统计学意义(0.85±0.06 vs 0.83±0.03，n=3，P>0.05)。结果见图2。

　　2.3 Cx43在大鼠颈动脉损伤后形成的新生内膜中的表达

　　在正常对照血管则未见血管新生内膜形成及血管腔狭窄(图3A)，而在颈动脉球囊损伤2周后，损伤血管内膜增生明显，血管管腔显著狭窄(图3B)。在球囊损伤后2周后血管组织切片免疫荧光染色发现，在形成的新生内膜中Cx43表达丰富(图3C、图3D)。

　　2.4 生胃酮对血管损伤后新生内膜形成的影响

　　结果显示，损伤2周生胃酮干预组血管新生内膜明显减轻，血管腔狭窄较单纯损伤组轻(图4A、图4B)。用新生内膜细胞核计数的方法[4]评价新生内膜形成情况显示，生胃酮干预组新生内膜细胞核数量显著低于对照组(89±28.40 vs 236±15.04，n=5，P<0.01)，见图5)。

　　3 讨论

　　机械、炎性等损伤因素损伤血管内皮可诱导炎性细胞浸入、VSMCs增殖，最终导致粥样硬化、斑块破裂及血管再狭窄，是粥样硬化斑块形成的始动因素，也是血管损伤后不良修复反应的主要原因之一。本研究也证实，在用球囊损伤颈动脉血管内皮后，出现血管平滑肌细胞增殖、迁移，14 d后内膜显著增生并导致血管管腔狭窄。因此，抑制血管损伤后出现的新生内膜形成是血管损伤性疾病防治的关键。而探讨新生内膜形成机制又是防治血管损伤后新生内膜过度增生的研究热点之一。

　　近来研究发现，Cx43在新生内膜形成过程中具有重要作用。Yeh等[5]研究发现，在大鼠颈动脉损伤后9 d，新生内膜开始形成，并且在新生内膜中合成型血管平滑肌细胞表达丰富的Cx43。Déglise 等[6]将人隐静脉段置于培养液中体外培养14 d后发现血管的内膜显著增厚，而在增厚的血管内膜平滑肌细胞中可以检测到大量的Cx43表达。Christos等[7]采用Cx43基因敲出小鼠模型观察颈动脉损伤后新生内膜形成情况发现，在敲出Cx43小鼠中形成的新生内膜显著少于野生型小鼠形成的新生内膜。我们的研究也显示，在颈动脉损伤后形成的新生内膜中免疫荧光染色可见丰富的Cx43表达，这些均提示缝隙连接蛋白在血管平滑肌细胞增殖、迁移以形成新生内膜的过程中扮演重要角色。

　　为了进一步观察缝隙连接阻断剂对血管损伤后新生内膜过度增殖的影响，我们采用了大鼠颈动脉损伤模型，观察生胃酮对颈动脉损伤血管新生内膜形成的影响。结果显示，颈动脉损伤14 d后，对照组血管损伤部位内膜增生显著、管腔显著狭窄，而生胃酮干预组则见形成的新生内膜明显少于对照组而且管腔狭窄较轻。生胃酮是一种缝隙连接特异性的阻断剂，可有效阻断经缝隙连接介导的细胞间的通讯。本实验结果提示，生胃酮并不增加体外培养的大鼠主动脉平滑肌细胞中Cx43的表达。从而，也从另一个侧面说明，生胃酮主要通过阻断细胞间缝隙连接介导的细胞通讯来发挥作用，而不是通过减少缝隙连接蛋白的表达起作用。我们前面的实验也证实，缝隙连接阻断剂能够抑制血管平滑肌细胞的增殖并促进血管平滑肌细胞由合成型转化为收缩型[8]。而血管平滑肌细胞表型的转化是血管平滑肌细胞参与新生内膜形成的起始环节。因此，生胃酮抑制新生内膜形成可能主要与抑制血管平滑肌细胞由收缩型转化为合成型有关。

　　研究也表明，在动脉粥样硬化早期斑块中Cx43表达上调，而随着病情的进展及斑块成熟，斑块内的Cx43表达逐渐降低。他汀类药物能够抑制动脉粥硬化样斑块内Cx43的表达[9]。因此，缝隙连接介导的细胞通讯将可能是血管损伤性疾病防治的新靶点。

参考文献

　　[1] Sohl G， Willecke K. Gap junctions and the connexin protein family [J]. Cardiovasc Res， 2004， 62(2): 228232.

　　[2] 韩雅玲， 康 建， 王效增， 等. 低浓度脂多糖加速大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的过度增生[J]. 中国病理生理杂志， 2005， 21(5): 849854.

　　[3] Takeuchi H， Jin S， Suzuki H， et al. Blockade of microglial glutamate release protects against ischemic brain injury [J]. Experimental Neurology， 2008， 214 (1): 144146.

　　[4] Werner N， Junk S， Laufs U， et al. Intravenous transfusion of endothelial progenitor cells reduces neointima formation after vascular injury [J]. Circ Res， 2003， 93(2): e1724.

　　[5] Yeh HI， Lee PY， Su CH， et al. Reduced expression of endothelial connexins 43 and 37 in hypertensive rats is rectified after 7day carvedilol treatment [J]. Am J Hypertens， 2006， 19(2): 129135.

　　[6] Deglise S， Martin D， Probst H， et al. Increased connexin 43 expression in human saphenous veins in culture is associated with intimal hyperplasia [J]. J Vasc Surg， 2005， 41(6): 10431052.

　　[7] Chadjichristos CE， Matter CM， Roth I， et al. Reduced connexin 43 expression limits neointima formation after balloon distension injury in hypercholesterolemic mice [J]. Circulation， 2006， 113(24): 28352843.

　　[8] 宋明宝， 黄 岚， 于学军， 等. 缝隙连接阻断剂对体外培养大鼠血管平滑肌细胞表型转化的影响[J]. 中国动脉硬化杂志， 2008， 16(2): 8588.

　　[9] Wang LH， Chen JZ， Sun YL， et al. Statins reduce connexin 40 and connexin 43 expression in atherosclerotic aorta of rabbits [J]. Int J Cardiol， 2005， 100(3): 467475.