P2嘌呤受体激动剂对血管平滑肌BKCa通道作用机制的研究

　　　　 作者：潘雪 汪晓凯 曾晓容 杨艳 蔡芳 李向楠

【摘要】 目的 探讨P2嘌呤受体激动剂对血管平滑肌大电导钙激活钾通道（BKCa)作用机制。方法 应用全细胞穿孔膜片钳记录技术，观察UTP对猪冠状动脉平滑肌细胞膜上BKCa介导的自发性瞬时外向钾电流（STOCs）的作用，并比较ATP与UTP对STOCs作用的强弱；以及磷脂酶C（PLC）的特异性阻断剂U73122预处理细胞后，UTP和ATP对STOCs的作用。结果 ①5～100 μmol/L的UTP可浓度依赖性的增加STOCs的幅度与频率，比较50 μmol/L的UTP和ATP对STOCs作用，二者无明显差异；②5 μmol/L的U73122处理细胞后50 μmol/L UTP和ATP无法激活STOCs，〔(22.76±6.43) pA，(0.222 7±0.097 7) Hz vs (23.28±8.43) pA，(0.195 3±0.061) Hz，n=7，P>0.05；(23.21±7.87) pA，(0.243±0.087 6) Hz vs (24.38±9.21) pA，(0.216 2±0.075) Hz，n=6，P>0.05〕。 结论 ATP和UTP可通过PLC途径激活猪冠状动脉平滑肌上的STOCs，UTP对其激活作用具有浓度依赖性，二者的激活效应无明显差异。

【关键词】 大电导钙激活钾通道；自发性瞬时外向钾电流；磷脂酶C； 三磷酸腺苷；三磷酸尿苷；穿孔膜片钳技术

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of P2 purinergic receptor agonists on large conductance calciumactivated potassium channels of vascular smooth muscle.Methods Perforatedpatch configuration of patchclamp technique was used to observe the effects of UTP and ATP on STOCs of porcine coronary smooth muscle cells as well as the effects after the cells were treated by phospholipase C( PLC) inhibitor. The effects of UTP and ATP on STOCs were compared. The cellular signal transduction mechanism of UTP and ATP effects on STOCs of porcine coronary smooth muscle cells were observed. Results ①UTP(5～100 μmol/L) significantly increased STOCs amplitude and frequency in a dosedependent manner. The effects of UTP and ATP on STOCs had no difference. ②When the cells were treated by phospholipase C (PLC) inhibitor U73122(5 μmol/L)， 50 μmol/L UTP and ATP did not increase STOCs amplitude and frequency 〔(22.76±6.43) pA， (0.222 7±0.097 7) Hz vs (23.28±8.43) pA，(0.195 3±0.061) Hz， n=7， P＞0.05；(23.21±7.87) pA， (0.243±0.087 6) Hz vs (24.38±9.21) pA， (0.216 2±0.075) Hz， n=6， P＞0.05〕. Conclusions UTP activates STOCs of porcine coronary smooth muscle cells through the PLC pathway， and increases STOCs amplitude and frequency in a dosedependent manner， the effects of UTP and ATP on STOCs have no difference.

　　【Key words】 BKCa; Spontaneous transient outward current; Uridine 5′triphosphate; Adenosine triphosphate; Phospholipase C; Perforatedpatch clamp technique

　　嘌呤受体（P2受体）在心血管系统高度密集，对心血管系统的功能具有重要的调控作用。P2受体分为配体门控非选择性阳离子通道受体（P2X）和G蛋白偶联受体（P2Y）两大类；P2X受体属离子通道型受体，P2Y受体属G蛋白偶联型受体。ATP和UTP作为细胞外信息分子（第一信使）激活细胞表面的P2受体，通过细胞内第二信使系统调节多种生理反应〔1〕。钾通道通过控制膜电位调节血管平滑肌功能，是动脉张力及直径的主要调节因素。动脉平滑肌细胞中已发现多种不同类型的钾通道，而大电导钙激活钾通道（BKCa）作为动脉平滑肌运载外向电流的优势通道，在调节血管平滑肌舒缩和负反馈调节小动脉肌源性紧张等方面有着重要作用〔2〕。在多种平滑肌细胞中都记录到了自发性瞬时外向钾电流(spontaneous transient outward currents，STOCs)，其可使膜电位超极化达-20 mV，其发生起源于BKCa通道的激活，Walsh等〔3，4〕证明STOCs与胞膜上大约15个左右的BKCa通道的同步开放相一致，增加和衰减极为迅速，大约持续100 ms，低频率的STOCs(1 Hz)即可明显影响膜电位〔4〕从而抑制电压依赖性钙通道(VDCC)，使钙流入减少，为平滑肌的收缩提供负反馈抑制〔5，6〕。

　　有研究证实ATP和UTP可通过对STOCs的调控而调节平滑肌的张力〔8，9〕，但有关细胞外ATP和UTP对BKca通道作用的研究报道较少，本研究应用膜片钳技术观察UTP和ATP对BKca通道产生的STOCs的作用，并初步探讨其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要溶液与试剂
　
　　台式液(mmol/L)：NaCl 127、 KCl 5.9、 MgCl2 1.2、CaCl2 2.4、葡萄糖（Glucose，Glu）12、羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）10， NaOH将pH调至7.4。无钙台式液(mmol/L)：NaCl 127、KCl 5.9、MgCl2 1.2、Glu 12、HEPES 10，NaOH将pH调至7.4。记录STOCs电极内液(mmol/L):钾天冬氨酸（Kaspartate，KASP）110，KCl 30，MgCl2 1，HEPES 10，NaCl 10，乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA） 0.05，pH值用KOH调至7.2左右；两性霉素B（amphotericinB，AmB） 在电极液中浓度为200 μg/ml。记录STOCs浴液(mmol/L)：NaCl 134，CaCl2 1.8，MgCl2 1，KCl 6，Glu 10， pH值用NaOH调至7.4左右。酶I（mg/ml）：木瓜蛋白酶 0.86，二硫苏糖醇（DTT）1.5，白蛋白2.0。酶II（mg/ml）胶原酶 1.24，透明质酸酶 1.5，白蛋白 1.5分别用无钙台式液溶解于小瓶内。

　　1.2 猪冠状动脉平滑肌细胞急性酶分离

　　参照文献〔7〕进行改良。在屠宰场处死猪（100～150 kg）后，迅速取出心脏并用生理盐水冲洗淤血，冷冻保存送往实验室。分离冠状动脉前降支及旋支分支，放入盛有台式液的器皿中，剔除血管壁上的脂肪组织和纤维组织，并除去内外膜。将血管斜行剪成2 mm×5 mm的组织块后将其放入酶I中， 37℃水浴振荡15 min后，转入酶液中，37℃ 水浴振荡7 min后，取出组织，放入无钙台氏液中，轻轻吹打，吸细胞悬液于显微镜下进行观察，待视野中出现较多细胞时停止消化，将细胞悬液滴于铺满小盖玻片的培养皿中静置于4℃冰箱中保存备用。待细胞贴壁后，先将盖玻片用浴液清洗2遍再移至浴槽内进行实验。

　　1.3 穿孔电极液的配制

　　根据文献〔8，9〕利用AmB进行穿孔，需预先配置贮备液：取AmB 5 mg加入25 μl二甲基亚砜（DMSO），在超声波振荡器中超声震荡助溶，贮备液在-20℃低温保存备用。实验前取5 μl加入5 ml不含AmB的电极液中，使其终浓度为200 μg/ml(在超声波振荡器中进行，其饱和浓度为120 μg/ml，达最大溶解)，DMSO在电极液中的浓度为0.1%。整个配制过程要避光。

　　1.4 全细胞STOCs的记录

　　取酶分离后8 h内冠脉平滑肌细胞，在室温(25℃)下，借助倒置相差显微镜，利用微推进器，控制微管电极入浴液，调节电极补偿旋钮，补偿电极液界电压至0；推进电极接近细胞，当微管电极尖端(充灌电极液后阻抗2～3 MΩ)轻触细胞后，向微管电极内施以负压，使微管电极尖端内与周围细胞间形成电化学绝缘，阻抗约10～100 GΩ，高阻封接形成后利用穿孔剂在细胞膜上形成高离子通透性的小孔来构成通电性回路。一般在孔道完全形成，即获得全细胞构形后，补偿串联电阻使其最小，慢电容补偿后即可对细胞进行电压钳制。STOCs的记录方案：测试电位(test potential，TP)-30 mV，脉冲时程100 s。刺激脉冲通过pClamp9.0软件控制的D/A转换器(Digidata 1322A，Axon Instruments)操纵，记录信号经A/D转换后存入计算机硬盘。采样频率为10 kHz，低通滤波器的频率为2 kHz。穿孔膜片钳Rs＜30 MΩ，当电流＞200 pA时，需要调节串阻补偿。全细胞电容在本实验中部分补偿。形成全细胞模式记录出通道电流后，稳定10 min，加入ATP 和UTP，观察UTP对STOCs的影响， 加药后5 min记录。用磷脂酶（PLC）抑制剂u73122(5 μmol／L) 处理细胞，再观察ATP 和UTP对STOCs作用的变化。

　　1.5 统计学分析

　　采用SPSS12.0软件进行统计学分析，数据以x±s表示，采用配对t检验。

　　2 结 果

　　2.1 电流的电压依赖性随机性及变异性

　　TP为-30 mV，钳制时间(clamp time，CT)为100 s时，可在76%的细胞(13例细胞中有10例能记录到)上记录到随机性STOCs，峰值幅度与频率均具有较大的变异性。表明该电流具有明显的电压依赖性，随着去极化电压的增大，通道电流幅值和频率逐渐增加 (n=5)。见图1（A，B）。

　　2.2 卡律蝎毒素 (charybdotoxin ChTX)对STOCs的影响

　　在浴液中加入BKCa通道的特异性阻断剂ChTX，200 nmol/L的ChTX可完全阻断记录到的外向电流(n=6)。见图2。

　　2.3 不同浓度ATP和UTP对STOCs的作用

　　向浴液中加入 UTP，使其终浓度分别为5、10、50、100 μmol／L时， STOCs电流幅度及电流频率逐渐增加，呈浓度依赖性。对ATP和UTP终浓度为50 μmol／L时的数据进行统计，UTP使二者由（23.53±2.55）pA、（0.216 7±0.021 7）Hz；增加到（40.76±5.75）pA，（0.369 5±0.035 8）Hz(n=7，P<0.01)，ATP使 STOCs的电流幅度和电流频率分别由（26.31±3.5）pA，（0.232±0.036）Hz 增加到（45.12±4.17）pA ，（0.357±0.051）Hz（n=6，P<0.01)，比较两者使 STOCs的电流幅度和电流频率增长值无明显差异。见图3、图4。

　　2.4 U73122对UTP和ATP作用的影响

　　浴液中加入PLC的特异性阻断剂U73122(5 μmol/L) 预处理细胞(15 min)，分别加入50 μmol/L UTP和ATP电流幅度及频率变化为〔(22.76±6.43) pA，(0.222 7±0.097 7) Hz vs (23.28±8.43) pA，(0.195 3±0.061) Hz，n=7，P>0.05〕；〔(23.21±7.87) pA，(0.243±0.087 6) Hz vs (24.38±9.21) pA，(0.216 2±0.075) Hz，n=6，P>0.05〕，与加入UTP和ATP前相比无明显变化。见图5。

　　3 讨 论

　　3.1 STOCs的基本特性

　　随着激光共聚焦显微镜结合膜片钳技术的广泛应用， 人们在多种平滑肌细胞中观测到一种新的钙信号活动，即钙火花〔3～6〕。它是细胞内肌浆网(sarcoplasmic reticulum，SR)上一个或一些紧密成簇分布的兰诺定受体通道(ryanodine receptor，RyR)产生的一过性局部微小钙释放活动，对胞内Ca2+浓度几乎没有影响，但可通过激活胞膜上BKCa产生STOCs使膜超极化，从而抑制VDCC，使钙流入减少，为平滑肌的收缩提供负反馈抑制〔6〕。BKCa对于胞浆中的钙具有低敏感性，当钙浓度大于1 μmol/L时才可使其明显激活。BKCa的分布与钙火花发放位点极为接近，因此，当胞内的RyR被激活时，其可感受到快速阶梯似的钙浓度改变而被激活产生STOCs。本实验表明，STOCs具有以下特征：① STOCs的出现具有随机性，幅度与频率的大小也具有变异性。②具有电压依赖性。③此成分对BKCa的特异性阻断剂ChTX敏感，提示记录到的电流是由BKCa所携带。均与文献报道相一致〔8，9〕。

　　3.2 ATP和UTP对STOCs的作用

　　实验观察到ATP和UTP可浓度依赖性的增加STOCs的幅度与频率，且ATP和UTP的作用强度相近，与P2受体分类中的P2Y受体的激动剂效价顺序(UTP=ATP>ADP>α，βMeATP，2MeSATP)相符〔11〕。实验中PLC的特异性阻断剂U73122预处理细胞后，ATP和UTP无法激活STOCs，提示ATP和UTP通过PLC途径激活STOCs。研究发现不论在结肠肌细胞和还是在脑动脉平滑肌中，P受体激动剂都可通过P2Y受体激活PLC，而调控胞膜上的STOCs 〔10～13〕，PLC主要是通过水解二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）生成肌醇三磷酸（IP3）与二脂酰甘油（DG），前者可与肌浆网或内质网上的IP3受体(IP3R)结合释放钙离子使胞内钙离子浓度升高，从而激活多种钙依赖的反应〔14〕。DG则能激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，通过对底物蛋白磷酸化而影响细胞的功能〔15〕。UTP和ATP作为细胞外信息分子(第一信使)激活细胞表面的P2受体，调节多种生理反应，尤其是对心血管系统的生理及病理生理活动具有重要作用。

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