Ghrelin对THP1源性泡沫细胞ATP结合盒转运子G1的调控作用及途径

　　　　 作者：王彦富 成蓓 万晶晶 梅春丽 刘玮 柯丽 何平

【摘要】 目的 探讨Ghrelin对人单核细胞系（THP1)源性泡沫细胞ATP结合盒转运子G1(ABCG1)表达的调控作用及其可能途径。方法 体外培养THP1，由佛波酯(PMA)作用使其分化为巨噬细胞，继而在氧化低密度脂蛋白(oxLDL)存在条件下进一步转变为泡沫细胞，油红O染色法鉴定泡沫细胞形成。运用RTPCR法和Western印迹法分别检测Ghrelin干预后及封闭过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)后ABCG1 mRNA与蛋白表达。采用酶法，通过荧光分光光度计检测胆固醇含量及胆固醇流出率。结果 Ghrelin可明显减少细胞内脂滴的形成，增加胆固醇流出，并能显著增加单核／巨噬细胞泡沫化过程中ABCG1 mRNA水平和蛋白表达，此作用呈浓度依赖性。封闭PPARγ后，Ghrelin抑制泡沫细胞形成的效应被阻断，且PPARγ拮抗剂浓度越高，该阻断作用越明显。结论 Ghrelin可能通过上调ABCG1转录翻译水平延缓动脉粥样硬化的发生，且该效应可能通过PPARγ途径发挥作用。

【关键词】 Ghrelin；过氧化物酶体增生物激活受体γ；ATP结合盒转运子G1；泡沫细胞；动脉粥样硬化

　　【Abstract】 Objective To investigate the effects of Ghrelin on the expression of ATP binding cassette transporter G1 (ABCG1) in THP1 derived foam cells and its possible mechanism. Methods Human monocytic leukemia cell line (THP1) was chosen. The differentiation of THP1 cells into macrophages was induced by phorbol myristate acetate (PMA). Macrophages were then incubated with oxidized LDL (oxLDL) to generate foam cells. Ghrelin and antagonist of PPARγ were treated during foam cells formation. The ABCG1 protein and mRNA levels were detected by Western blotting and RTPCR. The effect of variance of cholesterol content was measured by zymochemistry viafluorospectrophotometer. Results Ghrelin increased the cholesterol efflux obviously. ABCG1 protein and mRNA levels were also decreased. The antagonist of peroxisome proliferatoractivated receptorγ (PPARγ) inhibited the effects of Ghrelin on ABCG1 expression in dosedependent manner. Conclusions Ghrelin might interfere atherosclerosis by upregulating the expression of ABCG1 via PPARγ pathway.

　　【Key words】 Ghrelin；Peroxisome proliferatoractivated receptorβ；ATP binding cassette transporter G1；Foam cell；Atherosclerosis

　　ATP结合盒转运子G1(ABCG1)是近年发现的膜蛋白。在动脉壁，ABCG1是单核巨噬细胞内胆固醇流出的重要途径，同时还能促进磷脂类及其他亲脂类化合物的流出，有助于清除脂质，防止泡沫细胞形成〔1，2〕。Ghrelin是一种促生长激素释放肽，与糖脂代谢及相关疾病有密切联系。流行病学研究发现血浆Ghrelin水平与代谢综合征的老年患者颈动脉粥样硬化（AS）呈负相关〔3〕，提示Ghrelin在AS的发展中扮演着有益的角色。本研究探讨了Ghrelin对单核／巨噬细胞泡沫化过程中脂质小滴含量、ABCG1蛋白变化及mRNA水平的调控作用，并对其可能的调控途径进行研究，以揭示其抗AS的效应及其机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人单核细胞株(THP1)购自武汉大学典型培养物保藏中心；胎牛血清、RPMI 1640培养基购自Gibco公司；Ghrelin购自Anaspec公司；佛波酯(PMA)、牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；RTPCR试剂盒购自杭州博日科技有限公司；PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成；鼠抗人ABCG1抗体购自Abam公司；PPAR7特异性抑制剂GW9662购自Alexis公司，ECL试剂购自Pierce公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养及实验设计

　　THP1细胞按照美国标准生物品收藏中心(ATCC)的说明进行培养和传代，即用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基进行细胞培养达一定数量后分瓶传代。THP1细胞于含PMA 160 nmol／L、0.3％ BSA的无血清1640培养基中培养48 h，使单核细胞分化为巨噬细胞。上述巨噬细胞弃去培养基，加入0.3％ BSA的无血清1640培养基与氧化低密度脂蛋白(oxLDL)100 mg／L共同孵育24 h，使之转变为泡沫细胞。①巨噬细胞加入不同浓度的Ghrelin，使培养基中Ghrelin终浓度分别为10-5、10-6 mol／L及10-7mol／L，预孵2 h，加入无血清1640培养基与oxLDL，共同孵育24 h。②巨噬细胞加入终浓度分别为10、20及50 μmol/L的GW9662预孵2 h，之后加入终浓度为10-5mol／L的Ghrelin孵育2 h，再加入100 mg／L的oxLDL共同孵育24 h。随后各组均加入10 mg／L的载脂蛋白A（ApoA）I，CO2培养箱中孵育12 h。

　　1.2.2 低密度脂蛋白(LDL)的制备、氧化修饰及鉴定

　　参照文献方法〔4〕，健康供血者血清采用两步密度梯度离心法获取LDL，加入终浓度为10 μmol／L的CuCl2，37℃充分氧化24 h，梯度琼脂糖凝胶电泳鉴定oxLDL的形成。oxLDL于含0.5 mmol／L的EDTANa2的PBS中终止氧化，每1 h换液1次，透析24 h。用聚乙二醇浓缩后进行浓度测定，除菌保存。

　　1.2.3 ABCG1 mRNA检测

　　Trizol裂解细胞，氯仿异丙醇提取RNA。根据RTPCR试剂盒说明书进行逆转录及PCR反应。ABCG1上游引物：5′ATGTAGGCAGATTGGTGGTTT3′，下游引物：5′TGCTAAGGAGCGACTGGACT3′，产物为127 bp；PCR反应条件：94℃变性30 s，57℃复性30 s，72℃延伸45 s，33个循环，末次循环72℃延伸5 min。βactin上游引物：5′GTCCACCTTCCAGCAGATGT3′，下游引物：5′CACCTTCACCGTTCCAGTTT3′，产物为245 bp；PCR反应条件：94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸45 s，32个循环，末次循环72℃延伸5 min。取扩增产物5 μl与上样缓冲液混合进行2％琼脂糖凝胶电泳，并与标准分子量比较，鉴定扩增产物。

　　1.2.4 ABCG1蛋白表达检测

　　取细胞，PBS 4℃洗涤后加入去污裂解缓冲液进行细胞裂解，4℃离心30 min，弃除沉淀，用Bradford法测蛋白浓度。取5 μg蛋白质加入上样缓冲液中，100℃加热10 min使蛋白质变性。10％ SDSPAGE胶进行电泳分离，转膜，封闭，按1∶200加入鼠抗人ABCG1单克隆一抗，4℃孵育过夜，按1∶5 000加入羊抗鼠二抗，37℃ 2 h，TBSTween缓冲液洗膜10 min×3次。ECI试剂发光，X光片压片曝光。Labworks图像分析系统分析面积灰度值。

　　1.2.5 胆固醇含量及胆固醇流出率测定

　　采用酶法，通过荧光分光光度计检测细胞内胆固醇含量的变化，参照文献〔5〕操作。收集各组剩余细胞以无菌PBS洗涤3次，应用超声波细胞粉碎仪破碎细胞，取10 μl，加入试剂后，37℃水浴反应60 min，采用HITACHI 65060型荧光分光光度计，以325 nm为激发光波长，415 nm为荧光发射波长，以1～10 μg／ml标准胆固醇绘制标准曲线，测得总胆固醇的量，以mg／g蛋白为单位。胆固醇流出率=〔培养液胆固醇／(培养液胆固醇+胞内胆固醇)〕×100％。

　　1.3 统计学分析
　
　　以上实验均重复3次。用SPSS12.0软件进行统计学分析，检测结果以均以x±s表示，进行t检验和单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 THP1源性泡沫细胞鉴定及干预后胞内脂滴改变

　　THP1细胞与PMA(160 nmol／L)培养48 h后分化为巨噬细胞，巨噬细胞与10 mg／L。OxLDL共同孵育24 h后，细胞中形成大量脂质小滴，经油红O染色呈红色颗粒状，提示巨噬细胞转变为泡沫细胞。通过油红O染色观察，可见不同干预组细胞内脂质含量明显不同。见图1。

　　2.2 不同浓度Ghrelin干预后ABCG1的表达

　　2.2.1 ABCG1蛋白水平的变化

　　与泡沫细胞组相比，不同浓度Ghrelin干预组ABCG1蛋白表达明显增高(P<0.05)，且Ghrelin浓度越高，ABCG1蛋白表达越高(P<0.05)。见图2。

　　2.2.2 ABCG1 mRNA水平的变化

　　与泡沫细胞组相比，不同浓度的Ghrelin干预组ABCG1 mRNA水平明显增高(P<0.05)，且Ghrelin浓度越高，ABCG1 mRNA水平越高(P<0.05)。见图2。

　　2.3 Ghrelin与不同浓度GW9662共同干预后ABCG1的表达

　　2.3.1 ABCG1蛋白水平的变化

　　GW9662对照组与泡沫细胞对照组ABCG1蛋白表达无明显差别(P>0.05)。与泡沫细胞对照组相比，Ghrelin干预组ABCG1蛋白表达明显增加。加入PPARγ抑制剂GW9662后，Ghrelin增加ABCG1蛋白表达的作用被阻断，且GW9662浓度越高，ABCG1蛋白表达越低(P<0.05)。见图3。

　　2.3.2 ABCG1 mRNA水平的变化

　　GW9662对照组与泡沫细胞对照组ABCG1 mRNA水平无明显差别(P>0.05)。与泡沫细胞对照组相比，Ghrelin干预组ABCG1 mRNA的水平明显增高。加入PPARγ抑制剂GW9661后，Ghrelin增加ABCG1 mRNA水平的作用被阻断，且GW9662浓度越高，ABCG1 mRNA水平越低(P<0.05)，见图3。

　　2.4 胞内总胆固醇含量变化及胆固醇流出率测定

　　Ghrelin干预后胞内总胆固醇含量下降，降幅为(38.2±1.9)％。PPARγ抑制剂GW9662阻断了Ghrelin减少胆固醇含量的效应，不同浓度GW9662组胞内总胆固醇含量较Ghrelin组分别增加了(18.3±4.3)％，(30.6±11.4)％，(52.6±8.4)％。Ghrelin同时增加了胞内胆固醇的流出率，而GW9662则抑制了Ghrelin这种效应，见表1。表1 各组胞内胆固醇含量及胆固醇流出率(略)

　　3 讨 论

　　巨噬细胞内胆固醇酯蓄积形成泡沫细胞是AS发生的早期事件和关键环节，泡沫细胞内胆固醇的有效流出即胆固醇逆转运，可以减轻泡沫细胞的泡沫化，延缓AS的形成。ABCG1是泡沫细胞内胆固醇逆转运的重要途径，它在介导胆固醇转运的同时还能促进磷脂和一些亲脂类化合物流出。转基因研究证实，ABCG1的过度表达促进胆固醇从巨噬细胞流出，并抑制AS斑块的形成〔6〕。ABCG1的表达调控可能在AS的形成中起重要作用，如何调控成为人们关注的焦点。

　　流行病学研究发现血浆低Ghrelin水平与代谢综合征的老年患者颈AS有相关性，而且Ghrelin能改善代谢综合征患者的内皮功能〔7，8〕，提示Ghrelin在预防AS的发展中扮演着有益的角色。实验结果显示：①Ghrelin对THP1源性泡沫细胞的形成具有明显的抑制作用；②经不同浓度的Ghrelin干预后，ABCG1蛋白表达显著增加；且Ghrelin浓度越高，ABCG1蛋白表达越高(P<0.05)，提示Ghelin上调ABCG1蛋白表达呈浓度依赖性：③经不同浓度的Ghrelin干预后，ABCG1 mRNA水平显著增高；且Ghrelin浓度越高，ABCG1 mRNA水平越高(P<0.01)，提示Ghrelin上调ABCG1 mRNA水平也呈浓度依赖性；④Ghrelin显著增加胞内胆固醇流出(P<0.05)。ABCG1主要位于细胞膜上，这种结构有利于将脂质由胞内转运至胞外；而且其转运的主要是胞内的游离胆固醇，使得这些胆固醇无法在胞内蓄积形成胆固醇酯脂质小滴。Ghrelin能上调ABCG1转录与表达，减少胞内游离胆固醇含量，抑制游离胆固醇在胞内蓄积形成胆固醇酯，从而抑制泡沫细胞的形成。

　　PPARγ属于核受体超家族成员，激活后参与调控与脂类代谢相关的基因表达，对体内的糖脂代谢有重要影响。在巨噬细胞中，PPARγ同样参与基因调控从而调节脂质稳态。有研究表明，将老鼠巨噬细胞中PPARγ特异性敲除后，动脉壁脂质平衡被打破，加剧了AS的发展〔9〕。PPARγ发挥抗AS的作用机制还包括介导胆固醇从巨噬细胞中流出和抑制巨噬细胞向内皮下迁移形成粥样斑块〔10〕。实验结果显示：①泡沫细胞经Ghrelin干预后，ABCGl mRNA与蛋白水平显著增高(P<0.05)；②抑制PPARγ，能拮抗Ghrelin上调ABCG1 mRNA与蛋白水平的效应(P<0.05)；③对PPARγ抑制的越完全，Ghrelin对ABCG1 mRNA与蛋白水平的上调效应被阻断的越显著(P<0.05)；④PPARγ抑制剂阻断了Ghrelin对胆固醇流出的增加效应，且阻断作用呈剂量依赖性(P<0.05)。提示Ghrelin能通过PPARγ途径上调ABCG1的转录与表达水平，减少胞内游离胆固醇含量，抑制泡沫细胞的形成。

　　本实验结果可以看出，Ghrelin能通过上调泡沫细胞中ABCG1的表达抑制泡沫细胞的形成，而这种正性调控作用通过PPARγ发挥作用。这种有益的效应可能为临床预防和治疗早期AS提供基础实验依据，为寻求新靶点有效地干预和延缓AS的形成提供新思路。

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