作者：喻学桥 钱群 樊利芳 江从庆 吴云华 袁玉峰
【摘要】 目的：探讨缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和基质金属蛋白酶－7（matrix metal oproteinase-7，MMP-7）在直肠癌组织中的表达及相关性， 并评价二者在直肠癌进展中的作用。方法：采用免疫组织化学SP法检测52例直肠癌组织中HIF-1α和MMP-7蛋白表达情况， 分析二者的相关性及与临床病理特征的关系。结果：直肠癌组织中HIF-1α蛋白阳性表达率为67.3 %， 与对照组相比差异有统计学意义（ P<0.01） ， 且与淋巴结转移、Dukes分期情况相关（P< 0.01）。MMP-7蛋白在直肠癌组织中阳性表达率为71.2%， 显著高于对照组（P<0.01）， 且与淋巴结转移和Dukes分期情况也相关（P<0.05）。HIF-1α与MMP-7呈正相关（r＝0.478，P<0.01 ）。结论：HIF-1α和MMP-7在直肠癌的进展中起重要作用， HIF-1α可能通过调节MMP-7的过度表达参与直肠癌的发生发展。
【关键词】 直肠肿瘤·缺氧诱导因子·基质金属蛋白酶类
【ABSTRACT】Objective: To study the expressions and the relation of Hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α） and Matrix metal oproteinase-7（MMP-7） in rectal cancer and evaluate their roles in rectal carcinogenesis and development. Methods: The expressions of HIF-1α and MMP-7 in 52 cases of rectal cancer was detected by immunohistochemical SP technique. Results: The expression of HIF-1α in rectal carcinoma （67.3 %） was higher than that in control group （P<0. 01） . The positive rate of HIF-1α was closely related with local lymph node metastasis and Dukes stage （P<0. 01）. The expression of MMP-7 in rectal carcinoma （71.2 %） was much higher than in the control group （P<0. 01） and was closely related with local lymph mode metastasis and Dukes stage （P<0. 05）. The expression of HIF-1α was positively correlated with MMP-7 protein （r=0.478，P<0.01 ）. Conclusion: HIF-1α and MMP-7 play important roles in the evolvement of rectal carcinoma. HIF-1α may participate the occurrence and development of rectal carcinoma by regulating the excess expression of MMP-7.
【KEY WORDS】 Rectal neoplasms·Hypoxia inducible factor·Matrix metalloproteinases
缺氧诱导因子-1α（ hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α）是肿瘤细胞适应缺氧的中心调节因子。近年研究证实， HIF-1α在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌等肿瘤组织中高表达［１］。基质溶解酶（matrilysin， MMP-7）是基质金属蛋白酶（matrix metal oproteinases， MMPs） 家族中分子最小的一员，能通过降解细胞外基质（extracellular matrix， ECM）诱导和促进血管生成等机制促进肿瘤的侵袭、生长和转移［２］。本文应用免疫组织化学技术，检测HIF-1α、MMP-7在52例直肠癌组织中的表达情况， 探讨二者与直肠癌临床病理特征的关系以及二者之间的相关性。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集我院2002年8月—2003年3月经病理组织学检查确诊为直肠癌且资料完整的病例52例，其中男32例，女20例。年龄35 ~72岁，中位年龄53.5岁。所有病例术前均未接受放化疗。其中高分化腺癌14例；中分化腺癌27例；低分化腺癌7例，4例黏液细胞癌和印戒细胞癌也为的分化。Dukes分期：A期8例，B期15例，C期23例，D期6例。获取所有病例的病理组织蜡块。选择27例经HE染色证实手术切缘为正常直肠组织的蜡块为对照组。
1.2 主要试剂与检测方法 多克隆兔抗HIF-1α购自美国Santa Cruz公司；单克隆兔抗MMP-7和SP试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。
所有组织蜡块均4 μm连续切片，HE染色定位并行免疫组织化学染色。实验步骤按试剂盒说明进行，PBS代替一抗作阴性对照，阳性对照由购买试剂的公司提供。
1.3 结果判定标准 HIF-1α阳性染色主要为细胞质棕黄色颗粒沉着，少量核着色。参照Birner等［３］的方法，综合染色强度和阳性细胞占总细胞数的百分比进行半定量处理：着色弱但明显强于阴性对照者为1分，染色清晰者为2分，染色强者为3分；阳性细胞数10%～50%者为2分，51%～80%者为3分，>80%者为4分。上述两项评分相加：不管其染色强度，阳性细胞数< 10%为（－），3 分为（+） ， 4～5分为（+ +）， 6～7分为（+ + +）。 MMP-7蛋白以细胞核或细胞质有棕黄色颗粒为阳性，参照文献[4] ， 在5个200倍光镜视野下计算MMP-7阳性细胞和总细胞数之比， 染色以无明显阳性细胞为（－）， 阳性细胞数< 30 %为（ + ），30 %～50 %为（ + + ） ，> 50 %为（ + + + ）。
1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，计数资料做χ2检验及Fisher精确概率法， Spearman等级相关分析做相关性检验，P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HIF-1α蛋白的表达 HIF-1α在肿瘤坏死区域及浸润边缘表达明显，周围正常组织无表达（图1）。直肠癌组织中HIF-1α蛋白的阳性表达率67.3 %（35/52），其中10例（+） 、9例（+ +） 、16例（+ + +） ；对照组27例均无表达， 差异有统计学意义（χ2=18.667， P<0.01）。
HIF-1α表达与直肠癌患者性别及肿瘤大小、部位、组织学类型、远处转移均无明显关系（χ2= 0.079～1.128， P>0.05）。淋巴结转移患者HIF-1α阳性表达率显著高于无转移患者（χ2=14.881， P<0.01）；Dukes C+D期患者的阳性表达率，明显高于Dukes A+B期的患者（χ2=10.643，P<0.01，表1）。
2.2 MMP-7蛋白的表达 MMP-7主要表达于肿瘤细胞胞质（图2），在直肠癌组织中的阳性表达率为71.2 %（37/52），其中10例（+）、12例（+ +）、15例（ + + +）；27例正常直肠组织中无表达，两组差异有统计学意义（χ2=18.769， P<0.01）。
MMP-7表达与直肠癌患者性别及肿瘤大小、部位、组织学类型、远处转移均无明显关系（χ2=0.435～2.342 ， P>0.05）。淋巴结转移患者MMP-7阳性表达率明显高于无转移患者（χ2=7.238， P<0.05），Dukes C+D期患者阳性表达率明显高于Dukes A+B期的患者 （χ2=14.881， P<0.01，见表1）。
2.3 直肠癌组织中HIF-1α与MMP-7蛋白的相关性 经Spearman相关分析，直肠癌组织中HIF-1α与MMP-7表达呈正相关，rs=0.478，P<0.01（表2）。
3 讨论
HIF-1是机体适应缺氧的一种核心转录调节因子，由α亚基和β亚基组成。HIF-1α是HIF-1的功能性亚基，低氧对HIF-1活性的调节主要通过该亚基［５］。近年来研究表明，HIF-1α对葡萄糖转运子、糖酵解酶类、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等多种靶基因起着转录调控作用，并能促进血管生成、肿瘤增殖和转移，其表达和活性主要受氧浓度的调节，缺氧可使其表达增强，并通过激活一系列靶基因的转录，使肿瘤细胞获得对组织低氧和营养物质供应减少的适应能力，促进肿瘤的发生与发展［６］。Chen 等［７］研究发现，敲除HIF-1α基因或抑制HIF-1α的表达活性，肿瘤生长明显减慢。 Zhong等［1］发现， HIF-1α在肺癌、结肠癌、前列腺癌组织中过表达占90%以上，而在相应正常组织及一些良性病变中无表达，提示HIF-1α的表达与肿瘤的良恶性相关。本研究显示，HIF-1α在直肠癌组织中的表达率高达67.3%，而正常直肠组织无表达，且HIF-1α的表达与直肠癌淋巴结转移和Dukes分期密切相关，提示HIF-1α的表达可反映结直肠癌的生物学行为，可能成为判断结直肠癌浸润、转移的有价值指标。
MMPs是一类锌离子依赖性蛋白酶，能降解细胞外基质，促进血管新生、组织形成及破坏，在肿瘤的侵袭和转移中有着重要的作用。 MMP-7是MMPs家族中最小的成员，由肿瘤细胞本身产生，但也有报道发现其在肿瘤细胞邻近血管上皮细胞中表达［８］。Yoshimoto等［９］使用RT-PCR 技术对10例直肠癌检测MMP-7 mRNA表达，发现MMP-7 mRNA的表达随Dukes分期的增高而增加，在肝转移瘤中表达最高。本研究结果显示，MMP-7表达与Dukes 分期有关，与Yoshimioto等［９］报道一致， 提示MMP-7 的高表达是癌细胞侵袭能力增强的一个重要因素。同时本研究发现，发生淋巴结转移患者的MMP-7的表达量高于无淋巴结转移患者，推测MMP-7含量高的癌细胞更易于侵入淋巴管而形成淋巴结的转移，提示该指标可作为观察直肠癌进展和侵袭转移的一个指标。但本研究的远处转移患者（主要为肝转移）和无远处转移患者MMP-7、HIF-1α表达差异无统计学意义，需进一步研究来证实。
本研究结果显示直肠癌组织中HIF-1α与MMP-7表达呈明显正相关，推测HIF-1α可能通过直接或间接地上调MMP-7的表达促进了直肠癌的进展。目前研究比较明确的是，HIF-1α可以促进VEGF的转录，从而促进新生血管的生成；而VEGF具有诱导上调包括MMP-7在内的多种蛋白酶表达的作用［１０］，由此推测，HIF-1α可能通过促进VEGF的转录间接促进MMP-7的表达，从而发挥二者在促进恶性肿瘤侵袭和转移中的作用。另外，HIF-1α是否能直接调节MMP-7的表达尚需进一步研究。 随着二者作用机制研究的深入， HIF-1α和MMP-7有望成为预防和治疗直肠癌的新靶点。
参考文献
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