人参强心方对慢性心衰大鼠AngⅡ及其受体AT1 mRNA表达的影响

　　　　作者：邓国兴 张金兰 高玮 韩雪 张一昕 郭秋红 曹丽静

【摘要】 目的 观察人参强心方对慢性心衰大鼠血浆AngⅡ含量与心肌组织AngⅡ受体AT1 mRNA表达的影响，揭示人参强心方治疗慢性心衰的作用机制。方法 采用腹主动脉缩窄法复制慢性心衰大鼠模型，随机分为假手术组、模型组、阳性药对照组和人参强心方高、低剂量组。检测大鼠血浆AngⅡ的含量和心肌组织AT1 mRNA的表达变化。结果 模型组大鼠血浆AngⅡ含量明显增加，心肌组织中AT1 mRNA的表达明显增多；给药后，各治疗组大鼠AngⅡ的含量明显减少， AT1 mRNA的表达明显降低。结论 人参强心方能降低AngⅡ的含量，抑制AT1 mRNA的表达，可能是其治疗慢性心衰的分子机制之一。

【关键词】 人参强心方；心力衰竭；血管紧张素Ⅱ

　人参强心方具有益气养阴、活血强心之功，系本课题组经过多年临床筛选出的治疗慢性心衰的效方，既往药效学研究证实该方具有增强心肌收缩力、改善心功能的作用〔1〕，但其作用机制尚不十分清楚。肾素血管紧张素系统(RAS)过度激活在心衰的发生和发展中具有重要的意义，而RAS的各种生理活动主要是通过血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）产生的。本研究旨在通过观察人参强心方对心衰大鼠血浆AngⅡ含量以及心肌组织AngⅡ受体AT1 mRNA的表达变化，探讨其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物

　　健康雄性SD大鼠60只，体重180～200 g，清洁级，由河北省实验动物中心提供。合格证号：SCXK(冀)20031003。

　　1.1.2 实验药物

　　人参强心方由红参、生地黄、蟾酥等药物组成，由河北医科大学中药制剂室制备，每1 g相当于生药3.1 g。实验时制成所需浓度的水溶液。心宝丸（规格：20粒/瓶，批号：200509161），汕头市麒麟药业有限公司生产，实验时粉碎，过200目筛，用蒸馏水配成0.024 g/ml的混悬液。

　　1.1.3 实验仪器

　　FJ2020型γ射线免疫计数器（国营262厂）、PE9600型PCR扩增仪（美国PE公司）；电泳仪及电泳槽（北京六一公司）；凝胶图像分析系统（法国VL公司BIOPROFIF）。

　　1.1.4 主要试剂

　　AngⅡ试剂盒和醛固酮（ALD）试剂盒均购自北京东亚免疫技术研究所；Trizol RNA 试剂盒购自美国Invitrogen公司；PCR 试剂盒购自大连TaKaRa公司。

　　AT1的引物由北京塞百盛基因技术有限公司合成。以GAPDH为内参照。AT1上游引物为5′TCCACCCAATGAAGTCTCGCCT3′，AT1下游引物为5′GCACAATCGCCATAATTATCC3′，扩增片段长度为348 bp。GAPDH上游引物为5′CGCTAACATCAAATGGGGTG3′，GAPDH下游引物：5′ACAACCTGGTCCTCAGTGTA3′，扩增片段长度为600 bp。

　　1.2 方法

　　1.2.1 造模方法

　　参照相关文献〔2〕，采用腹主动脉缩窄法复制慢性心衰大鼠模型。大鼠行4%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，剑突下腹正中切口，分层打开腹腔，在肾动脉分支以上钝性游离腹主动脉，将7号注射器针头平行置于腹主动脉上，用4号手术丝线将腹主动脉和注射器一同结扎，然后缓慢将注射器撤出，关腹、分层缝合，使大鼠腹主动脉直径缩窄为0.7 mm。正常对照组开腹后将手术丝线穿过腹主动脉，除不缩窄腹主动脉外，其他操作与手术组完全相同。

　　1.2.2 动物分组及给药

　　大鼠于清洁级动物实验室内，正常喂养1 w后，随机分为5组，每组12只。（1）假手术组；（2）模型组；（3）人参强心方低剂量组，每日用药剂量为1.5 g/100 g；(4)人参强心方高剂量组：每日用药剂量为3.0 g/100 g；(5)阳性药（心宝丸）对照组：每日用药剂量为0.24 g/kg。各组灌胃1次/d，每次用药体积均按1 ml/100 g计算。造模4 w后，假手术组和模型组灌服蒸馏水，各治疗组灌服治疗药或对照药，共治疗4 w。实验8 w末于最后一次给药后禁食12 h，麻醉状态下股动脉取血2 ml，分别置于肝素、EDTA的抗凝试管中，4℃、3 000 r/min离心，分离血浆，同时切开腹部迅速剖取心脏，液氮冷冻。

　　1.2.3 检测指标及方法

　　1.2.3.1 血浆AngⅡ和ALD的测定

　　采用放射免疫法，严格按试剂盒说明书检测。

　　1.2.3.2 RTPCR法测定大鼠心肌AT1 mRNA表达

　　①采用Trizol常规一步法提取总RNA，然后测定RNA样品含量及纯度：A260/A280=1.8～2.0方可使用。②RT反应：取总RNA 1 μg，加入RT反应体系管（含AMV Buffer，dNTPs，Oligo dT Primer，AMV，Rnase Inhibitor等），并用DEPC处理水补足到10 μl反应液体积，震荡混匀后短暂离心，加少许矿物油于PCR仪50℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，-20℃保存备用。③PCR反应：50 μl反应体系含Taq DNA聚合酶、dNTPs、上样染料、稳定剂、优化剂、反应缓冲液、逆转录反应产物、上下游引物等。震荡混匀后短暂离心，加少许矿物油于PCR仪扩增。反应条件：变性94℃ 40 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 90 s，30个循环，最后延伸10 min。④半定量分析：取每个标本的扩增产物6 μl于1%的含GV核酸染料的琼脂糖凝胶电泳， 以DNA Marker（ DL2000）作为标准分子量标记，电泳后于紫外透射仪观察，并用数码相机照相，输入微机，应用法国VL公司凝胶图像分析系统分析软件对目的电泳条带进行分析，以相应的内参电泳条带作为参照，结果以两者之积分吸光度的比值表示。

　　1.3 统计学分析

　　计量资料用x±s表示，多组间比较用单因素方差分析和LSD检验，采用SPSS12.0统计软件分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠血浆AngⅡ、ALD的变化

　　模型组大鼠血浆AngⅡ、ALD的含量均明显高于假手术组（P＜0.01）。用药后，与模型组比较，高、低剂量组和对照组AngⅡ、ALD的含量均明显降低（P＜0.01），且高剂量组低于低剂量组和对照组（P＜0.01或P＜0.05），而低剂量组和对照组之间无明显差异（P＞0.05）。见表1。表1 各组大鼠血浆AngⅡ、ALD含量和AT1 mRNA的表达变化(略)

　　2.2 各组大鼠心肌组织中AT1 mRNA的表达变化

　　RTPCR后，琼脂糖凝胶电泳在600 bp、348 bp处分别显示出GAPDH和AT1电泳带，与预期结果一致。见图1。模型组大鼠心肌组织AT1 mRNA表达明显高于假手术组（P＜0.01）；给药后，各用药组AT1 mRNA表达明显降低（P＜0.01）；其中高、低剂量组AT1 mRNA的表达低于对照组（P＜0.01），而高、低剂量组之间无显著性差异（P＞0.05）。见表1。

　　3 讨 论

　　心力衰竭是各种心脏疾病的终末阶段，是危害人类健康、致死的主要因素之一，研究表明，慢性心衰与神经内分泌系统的激活有关，尤以RAS系统激活为主。RAS系统的主要活性物质为AngⅡ，AngⅡ具有收缩血管、正性肌力、刺激ALD分泌和促进交感神经末梢释放儿茶酚胺作用。大量资料显示：心衰大鼠的AngⅡ含量均高于正常大鼠，说明慢性心衰时，RAS系统被激活，而RAS系统的主要生物活性物质AngⅡ明显增加。

　　AngⅡ受体可以分为AT1、AT2、AT3和AT4四种亚型。AngⅡ主要是通过AT1受体产生生物学效应的，因此AT1是AngⅡ发挥作用的关键靶分子。近几年国内外对于心衰AT1受体表达问题报道不一〔3〕，但多数学者认为心肌肥厚、心肌纤维化及心梗后心功能不全时AT1受体表达增加。

　　本实验结果表明：心衰时，AngⅡ及其受体AT1 mRNA的表达增加，与假手术组比较有统计学意义，说明AT1的表达上调在心衰发生发展中具有重要的作用。人参强心方能有效降低AngⅡ的含量，抑制AT1 mRNA过度表达，进一步揭示了人参强心方治疗慢性心衰的分子作用机制。

参考文献

　1 曹丽静，张江华，张一昕，等.人参强心滴丸对戊巴比妥钠心衰狗心功能的影响〔J〕.河北中医药学报，2001；16（3）：47.

　　2 Anversea P，Hagopian M，Alder V.Quantitative radioautographic localization of protein synthesis in experimental cardiac hypertrophy〔J〕.Lab Invest，1973；29(3)：282.

　　3 常文舒.血管紧张素Ⅱ1型受体基因表达的稳定性研究〔J〕.中国循环杂志，2001；2:9.