芪蛭益肺颗粒对COPD大鼠模型SPA表达和超微结构的影响

　　　　 作者：李金田 张莉 刘永琦 李娟 张毅 魏舒

【摘要】 目的 探讨芪蛭益肺颗粒对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠模型肺表面活性物质相关蛋白A(SPA)表达及肺组织超微结构的影响。方法 运用气管内滴注脂多糖加烟熏28 d法建立COPD大鼠模型，免疫组化法检测SPA表达及透射电镜观察肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构变化。结果 与空白组比较，模型组大鼠SPA表达明显减少，有显著差异(P<0.01)，肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构不完整;与模型组比较，芪蛭益肺颗粒治疗组大鼠SPA表达明显增强，差异显著(P<0.01)，肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构完整。结论 芪蛭益肺颗粒可显著提高模型大鼠SPA表达，改善细胞超微结构，对COPD的发生起到预防保护作用。

【关键词】 芪蛭益肺颗粒;COPD;SPA;超微结构

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和﹙或)肺气肿 ，气流受限不完全可逆，呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关〔1〕。据世界卫生组织预计，至2020年COPD将成为世界疾病经济负担的第五位〔2〕。在我国，在老年人易患疾病中，慢性支气管炎与肺气肿居第三位，而病死率为第一位〔3〕，对老年人健康生命的威胁越来越严重，因此COPD的预防和治疗已成为国内外学者研究的热点问题之一。本课题通过实验研究观察了纯中药制剂芪蛭益肺颗粒对COPD的疗效及其对肺组织表面活性物质相关蛋白(SPA)表达和超微结构的影响作用，为其在COPD临床治疗中的广泛应用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 选取SPF级健康Wistar大鼠60只，体重(200±20)g，雌雄各半﹙由甘肃中医学院动物实验中心提供，合格证号：SCXK(甘)20040006)。

　　1.2 药物 芪蛭益肺颗粒﹙由黄芪、水蛭、党参等药物组成﹚浓缩煎液，由甘肃中医学院药物制剂室煎制;固本咳喘片，浙江台州南峰药业生产，批号：070504。

　　1.3 主要试剂及仪器 脂多糖(LPS，10 mg，美国Sigma公司，批号：L2880);兰州牌香烟(焦油量12 mg，烟气烟碱量0.8 mg，烟气一氧化碳量13 mg，甘肃烟草工业有限责任公司);SPA检测试剂盒﹙武汉博士德生物工程有限公司，批号：030209);有机玻璃熏箱48 L(20 cm×40 cm×60 cm，自制);MiE显微图像处理软件一套﹙成都泰盟科技有限公司﹚;ES1000E型电子称一台﹙长沙湘平科技发展有限公司﹚;JEM1230型透射电镜一台﹙日本JEOL﹚。

　　1.4 动物分组及模型制备 大鼠常规饲养1 w后，随机分为：空白组、模型组、阳性药物对照组、芪蛭益肺颗粒大剂量治疗组、中剂量治疗组、小剂量治疗组，每组10只，雌雄各半。COPD大鼠模型制备

参考文献

〔4〕，采用气管内滴注LPS加烟熏28 d的方法。除空白组外，其余各组第1、14 天气管内滴注LPS(0.1 mg/100 g)，第2～13天，第15～28天，每日上午在容积为48 L玻璃密闭箱内持续熏兰州牌香烟雾30 min，每天1次，1支/只。每次熏烟后，将大鼠置于鼠笼内常规饲养。

　　1.5 给药方法 第15天空白组等体积生理盐水﹙2 ml/只)灌胃，阳性药物对照组给予固本咳喘片药液(0.324 g/kg)灌胃，芪蛭益肺颗粒大剂量(3.6 g/kg)、中剂量(1.8 g/kg)、小剂量治疗组(0.9 g/kg)均给予芪蛭益肺颗粒药液灌胃治疗。每日上午 1 次，干预治疗28 d，即大鼠共饲养42 d。

　　1.6 标本采集及检测

　　1.6.1 大鼠一般状态观察 观察各组大鼠一般状态﹙活动度、精神状态、皮毛光泽度、饮食情况、体重增幅﹚及大鼠咳嗽、气喘、鼻及呼吸道分泌物等症状并做记录。

　　1.6.2 各组大鼠肺组织SPA表达检测 各组大鼠用20%乌拉坦溶液1.0 g/kg腹腔内注射麻醉，取右肺下叶，置于10%中性甲醛固定液内固定48 h，常规石蜡包埋、切片，应用免疫组化法检测SPA表达，每张切片在同一放大倍数下随机选取3个视野，计数平均肺泡阳性细胞数(个∕肺泡)。

　　1.6.3 超微结构观察 取各组大鼠左肺下叶由脏层胸膜表面指向肺门方向的肺组织，切取截面约2 mm×1 mm肺组织条，放置在滴有戊二醛的硬纸板上，然后再从各条块切取大约1 mm×1 mm×1 mm大小的肺组织块，经预冷的2.5%戊二醛于4℃环境下固定24 h，再用1%锇酸后固定1 h，梯度乙醇和丙酮脱水，EPon812包埋，制成超薄切片，醋酸铀枸橼酸铅双重染色后，透射电镜观察。

　　1.7 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件处理，实验数据以x±s表示，采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠一般状态观察 空白组大鼠生长、进食及精神状态良好，反应灵敏，皮毛光泽，体肥。模型组大鼠进食量及活动明显减少，精神倦怠，皮毛稀疏无光泽，黄涩，体瘦，呼吸急促且均出现呼吸道分泌物增加、咳喘、流涎等症状，给药后，阳性药物对照组及芪蛭益肺颗粒治疗组大鼠较模型组大鼠进食及生长好，体重渐增，毛色无明显变化，无咳喘症状出现。

　　2.2 各组大鼠肺组织SPA的表达 空白组：肺泡破坏程度轻，肺泡结构完整，SPA表达多。模型组：肺泡破坏程度严重，肺泡结构不完整，SPA表达明显减少。阳性药物对照组：肺泡结构较完整，SPA表达较模型组多。芪蛭益肺颗粒大剂量治疗组：肺泡破坏程度明显减轻，SPA表达显著增强。芪蛭益肺颗粒中剂量治疗组：SPA表达较模型组增强，但不及大剂量组。芪蛭益肺颗粒小剂量治疗组：SPA表达接近模型组。见表1。

　　2.3 超微结构观察 空白组：大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞胞浆内有大量板层体和线粒体，板层小体结构清晰，呈球形，内有同心圆或平行排列的板层结构;线粒体嵴存在;细胞表面微绒毛数量较多，排列整齐，结构完整。模型组：细胞表面微绒毛明显减少、断裂甚至消失;板层体空泡化明显;线粒体肿胀、空泡化、嵴断裂;内质网扩张。阳性药物对照组：板层小体部分空泡化;细胞表面微绒毛数量较少;线粒体嵴存在，无明显扩张。芪蛭益肺颗粒大剂量治疗组：肺泡Ⅱ型上皮细胞结构完整，板层体空泡化明显减少;微绒毛数量明显增加;线粒体肿胀不明显;内质网无扩张。中剂量治疗组：板层体部分空泡化;线粒体轻度肿胀;微绒毛短小但较多。小剂量治疗组：肺泡Ⅱ型上皮细胞结构紊乱，板层体空泡化较多，线粒体发生肿胀，细胞表面微绒毛断裂缺失甚至消失。见图1。表1 各组大鼠SPA平均肺泡阳性细胞数与空白组比较：1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.01

　　图1 各组大鼠肺组织超微结构观察(×10 000)

　　3 讨 论

　　COPD的发生、发展是一个多因素的复杂过程，目前尚无能够减缓COPD病情发展和功能损伤的有效措施，因此，探索并研发新的、更有效的、能从根本上控制疾病进展的药物十分必要〔5，6〕。中医学认为：本病属本虚标实之证，本虚主要为肺、脾、肾三脏之虚，早期多为肺气虚，继而累及脾肾，致肺、脾、肾三脏俱虚;标实则为痰、热、瘀交互错杂致病。芪蛭益肺颗粒主要由黄芪、水蛭、党参等药物组成，具有标本兼治，虚实共调，益气培元，化痰活血，瘪皱肺胀之功效，在防治老年慢性支气管炎、肺气肿及COPD临床实践中获得了较为满意的临床疗效。有研究表明肺泡Ⅱ型上皮细胞表面活性物质减少是肺气肿发病的重要因素〔7〕。SPA是由肺泡合成并以板层体形式在细胞浆内储存的一种复合磷脂，主要生理功能是降低肺泡表面张力，维持肺泡结构稳定，防止其萎陷或过度扩张，调节肺顺应性，减少呼吸功，抗氧化损伤，而且关系到肺的局部免疫防御〔8，9〕，有保护肺组织、加快损伤肺组织修复的作用。最新科学研究已经证实：细胞线粒体损伤是产生老年慢性肺疾病的根源，通过透射电镜观察肺组织超微结构具有重要的现实意义。本实验结果显示：与空白组比较，模型组大鼠SPA表达明显减少，SPA平均肺泡阳性细胞数与空白组比较有显著差异，超微结构观察细胞器结构不完整;与模型组比较，芪蛭益肺颗粒治疗组大鼠SPA表达较模型组明显增强，SPA平均肺泡阳性细胞数与模型组比较有显著差异，超微结构观察细胞器结构较模型组完整;芪蛭益肺颗粒可显著改善模型大鼠一般状态与肺组织病变，以大、中剂量为优。提示可改善肺泡Ⅱ型上皮细胞结构破坏和提高SPA表达可能是芪蛭益肺颗粒防治COPD作用机制之一。

参考文献

　　1 石喜亮.慢性阻塞性肺疾病的中医辨治要点〔J〕.现代中医药，2006;26(3):467.

　　2 Pauwels RA，Buist AS，Calverley PM，et al.Global strategy for the diagnosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease.NHLBI/WHO Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease﹙GOLD﹚Workshop summary〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2001;163(5):125676.

　　3 中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2007年修订版)〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2007;30(l):817.

　　4 宋一平，崔德健，茅培英，等 慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及药物干预的影响 〔J〕.中华内科杂志，2000;39(8):5567.

　　5 Barnes PJ，Hansel TT.Prospects for new drugs for chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Lancet，2004;364(9438):98596.

　　6 Barnes PJ.ABC of chronic obstructive pulmonary disease:Future treatments〔J〕.BMJ，2006;333(7561):2468.

　　7 Friedrich B，Schmidt R，Reiss I，et al.Changes in biochemical and biophysical surfactant properties with cardiopulmonary byhass in children〔J〕.Crit Care Med，2003;31(1):28490.

　　8 金 靖.肺表面活性物质相关蛋白与临床肺疾病〔J〕.国外医学·儿科学分册，2003;30(3):1302.

　　9 王方勇，陈政良.SPA、SPD与肺部天然免疫防御〔J〕.免疫学杂志，2002;18(21):757