关于正交实验优选强骨胶囊水提部分制备工艺

作者：王庆伟 刘雪英 胡玉珍 梅其炳 刘莉　孙阳 朱彦荣

【摘要】 目的： 通过正交试验优选强骨胶囊水提部分的制备工艺. 方法： 建立高效液相色谱法测定二苯乙烯苷含量的方法，以二苯乙烯苷的含量为考察指标，考察提取时间、提取次数及水用量3个因素对提取结果的影响. 结果： 水提最佳工艺为: 6倍量的水，回流提取2次，每次3 h. 结论： 优选的提取工艺稳定，可行.
【关键词】 强骨胶囊；正交实验设计；高效液相色谱；二苯乙烯苷

　　 0引言
　　骨质疏松症(Osteoporosis， OP)以骨组织骨量减少、显微结构退化为特征，易发生低创性或无创性骨折的系统性骨胳疾病. 该病所致的疼痛、畸形及骨折严重降低了中老年人的生活质量，已成为世界范围内流行的危害人类健康的主要疾病. 本单位研制的强骨胶囊由续断、丹参、白术、黄芪、牛膝 、山茱萸、 熟地黄、制何首乌、山药等组成. 为了提高产品的质量，本研究通过正交实验，以二苯乙烯苷为指标，对强骨胶囊制备过程中水提部分的工艺进行了优选，为强骨胶囊合理的工艺、可控的质量提供依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　1.1.1仪器高效液相色谱仪(Waters 2695泵系统， 2996紫外分光检测器；Empower色谱工作站数据处理系统)； G16WS台式高速离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；冷冻干燥机（美国FTS公司）；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司产品).
　　1.1.2试药二苯乙烯苷对照品 (中国药品生物制品检定所 110844200404)；所用中药均购于陕西省药材公司并通过鉴定. 甲醇(CR，科密欧公司)；乙腈(CR， FISHERCHEMICALS）；乙醇(AR，天津市津北精细华工有限公司) ；超纯水. 其余试剂均为分析纯.
　　1.2方法
　　1.2.1正交试验设计采用L9（34）正交表安排实验，将制何首乌、山茱萸、 熟地黄、山药等4味药共同水提，以二苯乙烯苷含量为考察指标，每个实验的提取液分别过滤、合并、减压浓缩至干，选水提工艺，安排水提因素水平（表1）.
　　表1考察因素水平表
　　因素水平〖〗A〖〗B(倍)〖〗C(h)1〖〗1〖〗6〖〗1.02〖〗2〖〗8〖〗2.03〖〗3〖〗10〖〗3.0A：水提次数；B：水用量；C：提取时间.
　　1.2.2储备液的制备精密称取二苯乙烯苷对照品5.06 mg，用500 mL/L乙醇溶解并定容于10 mL棕色量瓶中制备储备液，4℃避光保存备用.
　　1.2.3样品及空白样品制备按照处方比例的1/10称取制何首乌、山茱萸、熟地黄、山药4味药，置回流提取器中，按L9（34）正交表安排实验，回流提取，提取液过滤，合并，减压浓缩，冷冻干燥. 精密称取干燥产品适量，加10 mL流动相超声溶解并定容于25 mL量瓶中，0.45 μm微孔滤膜过滤，高效液相色谱法测定. 取处方量山茱萸、 熟地黄、山药加8倍量水，水提取3次，每次2 h，合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥. 按照样品的制备方法制备空白样品.
　　2结果
　　2.1二苯乙烯苷含量测定方法建立
　　2.1.1色谱条件及方法专属性［2］色谱柱: Kromasil C18柱（ 250 mm×4.6 mm ）； 流动相: 乙腈∶水 = 22∶78 (v/v)；流速: 1 mL/min； 检测波长: 320 nm ； 柱温: 25℃.
　　在该色谱条件下，所用中药中的其他成分对二苯乙烯苷的测定几乎无干扰，分离良好，保留时间t=7.85 min( 图1 ).
　　A： 二苯乙烯苷对照品；B： 空白样品；C：样品.
　　图1二苯乙烯苷对照品、空白样品及样品色谱图
　　2.1.2二苯乙烯苷标准曲线制备与线性考察精密移取二苯乙烯苷储备液适量，用流动相逐步稀释成0.506， 5.06， 10.12， 20.12， 30.36， 50.60， 101.20 mg/L的二苯乙烯苷对照品溶液，于上述色谱条件下测定，记录色谱图，以对照品浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，二苯乙烯苷的回归方程为：Y=34031.46X+569.87，r=0.9998，二苯乙烯苷在0.506~101.20 mg/L的范围内呈良好的线性关系.
　　2.1.3精密度测定和稳定性实验将浓度分别为0.506， 30.36， 101.20 mg/L的二苯乙烯苷标准品溶液于同一天（12 h内）进样5次，于不同的3天再进样5次 ( 室温和正常照明条件下储存 )，记录色谱图，按回归方程计算浓度，测定工作曲线范围内低、中、高3个浓度的日内精密度和日间精密度以及二苯乙烯苷在该实验环境下的稳定性（表2）. 表2精密度与稳定性实验结果 　　精密度实验结果表明，二苯乙烯苷在该实验环境下，12 h内比较稳定，精密度小于3；而较长时间放置后不稳定；3 d后浓度明显降低，与文献报道［3］一致.
　　2.1.4加样回收率实验精密移取5 mL二苯乙烯苷含量为145.83 mg/L的样品溶液3份，分别精密加101.20 mg/L的二苯乙烯苷标准溶液1，2，4 mL，50 mL/L乙醇定容于25 mL棕色容量瓶中 ，0.45 μm微孔滤膜过滤，于上述色谱条件下，每次进样20 μL，记录色谱图，依照标准曲线计算二苯乙烯苷含量，并计算回收率（表3）. 表3回收率实验结果
　　2.2正交实验样品中二苯乙烯苷含量的测定及结果分析按照上述样品制备方法及色谱条件，依法测定正交实验样品，记录色谱图，依照标准曲线计算二苯乙烯苷含量（表4），结果进行方差分析.
　　3讨论
　　补益类中药在骨质疏松的防治中占有重要的地位［3］. 研究结果表明何首乌煎剂及水提物可抑制骨吸收，但不明显抑制骨形成. 而二苯乙烯苷为何首乌的主要水溶性成分［4-5］. 故本实验选用二苯乙烯苷为指标.
　　本实验建立的HPLC法测定二苯乙烯苷含量的方法灵敏、精密度高、重现性好，二苯乙烯苷在0.506~101.20 mg/mL的范围内呈良好的线性关系，可用于该实验样品中二苯乙烯苷的测定.
　　文献报道［6］，酸性、强碱性、光线、甲醇等是促使二苯乙烯苷发生化学变化的主要因素. 本实验的日间精密度实验也显示，即使在中性环境的溶液中，二苯乙烯苷在常温和正常光照的条件下储存时也不稳表4正交试验设计的结果定，在500 mL/L的乙醇溶液里，3 d后含量可下降7%左右，因此测定二苯乙烯苷含量时，尽可能避免用酸或碱性溶液配制，须避光储存，流动相中避免使用甲醇，尽可能在较短的时间内完成实验.
　　以二苯乙烯苷的含量为考察指标，根据正交实验直观分析及方差分析，表4显示，各因素对实验结果重要性依次为水提次数&>水用量&>提取时间. 方差分析结果表明，水用量、提取时间及提取次数对提取物中二苯乙烯苷含量影响有显著性意义. 两者综合考虑，可得出的最佳工艺为A2B1C3，即处方量的水提取药物，用6倍量的水，回流提取2次，每次 3 h，浸出物中二苯乙烯苷含量最高.
　　为验证所优选工艺的可靠性和重复性，按照优选的工艺提取5份样品，测定二苯乙烯苷的含量平均为17.53 mg/g，均高于正交实验9份样品的含量.
【参考文献】
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［4］ 黄莲芳，吴铁，谢华，等. 何首乌煎剂对去卵巢大鼠骨质丢失的防治作用［J］. 中国老年学杂志，2005，25(6):709-710.

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［6］ 班翊，刘其礼，金悠，等. 二苯乙烯苷的稳定性研究［J］. 中草药，2004，35（11）:1235-1236.