增殖抑制基因HSG与乳腺癌浸润和转移的有关性

　　　　　　　　 作者：付玉环 姜广建 夏庆安

【摘要】 目的： 研究增殖抑制基因（HSG）在乳腺癌组织中的表达，探讨其与乳腺癌发生、发展、浸润和转移的关系. 方法： 采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）和蛋白印迹（Western Blot）方法检测46例乳腺癌组织、27例乳腺增生组织、30例乳腺纤维腺瘤组织和18例癌旁正常乳腺组织中HSG mRNA及其蛋白的表达情况. 结果： 46例乳腺癌组织中HSG mRNA及其蛋白的相对表达水平和表达率分别为(0.87±0.14)和43.48%，（0.67± 0.11）和45.65%，其表达率显著低于癌旁正常乳腺组织的（1.28±0.09）和83.33%，（1.17±0.36 ）和88.89%；乳腺纤维腺瘤的（1.36±0.19 ）和86.67%，（1.23±0.28）和90.00%；乳腺增生组织的（1.19±0.12）和70.37%，(0.93±0.24)和74.07%(P&<0.05). 相关性分析表明，HSG的表达与肿瘤的组织学分级、淋巴结转移和ER有关(P&<0.05)，而与患者的年龄、肿瘤大小和TNM分期等无相关性（P&>0.05）. 结论： 乳腺癌患者HSG的低表达，更易发生淋巴结转移，提示HSG不仅与乳腺癌的发生发展有关，而且与乳腺癌的浸润和转移密切相关，可作为预测乳腺癌转移的重要生物学指标.
【关键词】 基因，抑制；乳腺肿瘤；逆转录聚合酶链反应；印迹法，蛋白质
　　0引言
　　乳腺癌的癌变是一个多基因参与，多阶段发展的过程，而细胞过度增殖是肿瘤发生发展的一个显著病理特征. 有研究报道，增殖抑制基因(hyperplasia suppressor gene，HSG)在血管再狭窄、动脉粥样硬化和高血压再塑等多种疾病动物模型中，可以明显抑制心血管疾病的细胞增殖、迁移和再塑，减轻和防治试验性心血管疾病的发生. HSG对多种肿瘤传代细胞系具有抗增殖及诱导凋亡的作用［1］. 但迄今为止，有关HSG在乳腺癌组织中的表达研究尚少见报道. 本研究拟通过RTPCR和Western Blot方法检测HSG mRNA及其蛋白在乳腺癌、乳腺增生、乳腺纤维腺瘤和癌旁正常乳腺组织中的表达，以探讨其与乳腺癌发生发展和浸润转移的关系.
　　1材料和方法
　　1.1材料收集200505/200612唐山市工人医院手术切除的乳腺癌标本46例，年龄53.5（25～69）岁；乳腺纤维腺瘤标本30例，年龄46.2（ 23～54）岁；乳腺增生组织标本27例，年龄41（ 29～51）岁. 同时收集200601/200606唐山市工人医院手术切除远离乳腺癌病灶（距肿瘤边缘&>3 cm， 经病理证实无肿瘤浸润）的相对正常乳腺组织标本18例，年龄57（45～69）岁. 所有病例均为女性，临床资料完整，并经病理诊断证实，术前未接受过放疗或化疗. 在乳腺癌标本中，浸润性导管癌41例，浸润性小叶癌3例，小叶原位癌2例，采用ScarfffBlormRichardson分级［2］方法进行组织学分级，其中Ⅰ级（高分化）19例，Ⅱ级（中分化）15例，Ⅲ级（低分化）12例. 所取新鲜标本在术后1.5 h内存放于-70℃液氮保存待用.
　　TRIzolRNA总提取试剂，2×Taq DNA聚合酶及焦炭酸二乙酯（DEPC）（北京天为时代科技有限公司）；MMLV逆转录试剂盒，dNTP， RTase， RNase H， 硝酸纤维素膜（普洛麦格北京生物技术有限公司）；兔抗人HSG多克隆抗体，由北京大学陈光慧教授馈赠；二步法PV9000试剂盒，DAB显色液及枸橼酸盐（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Bradford 蛋白定量试剂盒（北京天根生物技术有限公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1逆转录聚合酶链反应（RTPCR）① 组织总RNA的提取参照TRIzol试剂说明书进行；② RT:HSG基因引物序列：P1：5′CCCCCTTGTCTTTATGCTGCTGATGTT3′；P2：5′TTTGGGAGAGGTGTTGCTTATTTC3′，扩增片断为168 bp. 内参照采用人βactin基因，其引物序列：P1：5′CTACAATGAGCTGCGTGTGG3′，P2：5′AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC3′，扩增片断为498 bp. 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，PAGE纯化. RT参照MMLV逆转录试剂盒说明书进行；③ PCR:反应体系25 μL，每管加入2 μL RT产物作为模板，10 pmol特异性HSG或βactin基因上下游引物1 μL，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix和8.5 μL DDW. 反应条件: 94℃预变性5 min，94℃ 30 s， 55℃ 20 s，72℃ 30 s，共30个循环，最后72℃延伸6 min. 阴性对照用未做RT的总RNA做模板，空白对照在扩增时不加Taq DNA聚合酶；④ PCR产物的检测及半定量：取PCR产物5 μL，加样至15 g/L琼脂糖（含0.5 mg/L溴乙锭）凝胶样品孔中，在1×TAE缓冲液中电泳，反射紫外灯下观察并摄影，应用凝胶影像分析软件（Quantity One）测定每个条带的吸光度值，并计算HSG条带与内参照βactin的吸光度的比值，该值为HSG基因的相对表达值（RI），作为半定量RTPCR的结果.
　　1.2.2Western Blot检测提取总蛋白，经Bradford法蛋白定量，加热变性，设立空白和阴性对照. 每组分别取20 μg用以检测不同乳腺组织中HSG的蛋白含量. 经100 g/L SDSPAGE电泳，经湿式电转膜，用100 mA，2 h电转移至硝酸纤维素膜上，50 g/L脱脂奶粉封闭过夜，以兔抗人HSG多克隆抗体（稀释度1∶200）加在装有硝酸纤维素膜的自封袋中，37℃ 1 h，TTBS(TBS加入1 mL/L Tween20)洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗（稀释度1∶300）室温下摇动1 h，TTBS洗膜后经DAB显色. 用图像分析软件GELPro3.0对条带吸光度值进行分析，并测定出各组蛋白条带值与βactin的比值.
　　统计学处理： 数据结果以x±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料先作方差齐性检验，若方差齐，采用单因素的方差分析，方差不齐采用秩和检验；计数资料采用χ2检验. P&<0.05为差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1HSG在不同乳腺组织中的表达不同乳腺组织中的琼脂糖电泳分析结果显示（图1），在46例乳腺癌组织中HSG mRNA的相对表达水平及其表达率分别为（0.87±0.14）和43.48%，明显低于癌旁正常乳腺组织（1.28±0.09）和83.33%，乳腺纤维腺瘤（1.36±0.19）和86.67%及乳腺增生组织（1.19±0.12）和70.37% (P&<0.05)，差异具有统计学意义（P&<0.05）. Western Blot 的检测结果表明(图2)，HSG蛋白在46例乳腺癌组织中的相对表达水平和表达率分别为（0.67±0.11）和45.65%，明显低于癌旁正常乳腺组织（1.17±0.36 ）和88.89%，乳腺纤维腺瘤（1.23±0.28）和90.00%及乳腺增生组织（ 0.93±0.24）和74.07%，差异具有统计学意义（P&<0.05，表1）.
　　1： 空白对照； 2: 乳腺癌组织； 3: 乳腺增生组织； 4： 乳腺纤维腺瘤组织； 5: 癌旁正常乳腺组织； M： DNA marker.
　　图1HSG mRNA RTPCR部分产物琼脂糖电泳图（略）
　　1，2： 乳腺癌组织； 3，4： 乳腺纤维腺瘤组织； 5，6： 乳腺增生组织； 7，8： 癌旁正常乳腺组织.
　　图2Western Blot 检测结果（略）
　　表1HSG在不同乳腺组织的相对表达水平及阳性率（略）
　　aP&<0.05 vs 乳腺癌.
　　2.2乳腺癌组织中HSG mRNA和蛋白表达的相关性在46例乳腺癌组织HSG mRNA阳性病例中，HSG蛋白的阳性率为88.36%；HSG mRNA阴性病例中，HSG蛋白的阳性率为37.24%，其差异具有统计学意义（P&<0.01）.

　　2.3HSG蛋白在乳腺癌组织中的表达与临床病理特征之间的关系在46例乳腺癌组织中HSG蛋白的表达与组织分级、淋巴结转移和ER有关（P&<0.05），而与患者的年龄、肿瘤大小和临床分期等无关（P&>0.05，表2）.
　　表2HSG在46例乳腺癌中的表达与临床病理特征的关系（略）
　　aP&<0.05.
　　3讨论
　　增殖抑制基因HSG也称线粒体融合素基因2（Mitofusin 2，Mfn2），其全长cDNA序列为4.16 kb，开放阅读框架可编码757个氨基酸残基的蛋白质. HSG定位于线粒体外膜［3-4］，广泛分布于人、大鼠和小鼠的不同组织中，尤其在心肌和骨骼肌中表达非常丰富［3，5］. Chen等［1］的研究发现，HSG对大鼠血管平滑肌细胞(rat Vascular Smooth Muscle Cell， rVSMC)增殖的抑制作用是通过RasRafMEKERK1/2信号转导途径有效地阻遏细胞周期来实现的. 有研究［6］表明，HSG在不同来源的肿瘤细胞系都有不同程度的表达，其肺腺癌（A549）内源性HSG表达水平较低，而宫颈癌（HelaS3）细胞系表达水平较高. 我们的研究结果证实，HSG在基因和蛋白水平表达基本一致，HSG在癌旁正常乳腺组织中有较高的表达，其阳性率明显高于乳腺癌组（P&<0.05）. 并且，HSG的表达与临床病理参数的相关性分析表明，在24例淋巴结转移的患者中仅有8例HSG的阳性表达，而且随着肿瘤分化程度的降低，HSG的表达呈减弱趋势，且差异有统计学意义（P&<0.05）. 这提示HSG与乳腺癌的发生发展有着密切关系，HSG低表达的患者，乳腺癌组织分化更低，更易发生淋巴结转移. 其具体的作用机制可能是乳腺癌组织中HSG的低表达，使正常的细胞增殖分化转变为增殖分化不良，或者降低了对此增殖分化不良的抑制作用，导致细胞恶性增殖，从而促进乳腺癌的发生和转移. Karbouski等［7］研究发现，几乎在所有的凋亡细胞中HSG与Bax共定位. 李俐等［8］的研究发现，高表达Mfn2基因促进rVSMC的凋亡. 由此推测在乳腺癌组织中，HSG的低表达抑制了肿瘤细胞的凋亡，促进了肿瘤的发生［9］，与Mfn2可诱导乳腺癌细胞系MCF7细胞的凋亡有关.
　　综上所述，尽管HSG对肿瘤的抑制作用的具体机制尚不清楚，但HSG在乳腺癌中表达规律的研究，将为全面正确地揭示乳腺癌的发生发展和恶性转移提供一个新的证据，HSG有望成为预测乳腺癌转移的重要生物学指标之一.
【

参考文献

】
　　［1］ Chen KH， Guo X， Ma D， et al. Dysregulation of HSG triggers vascular proliferative disorders［J］. J Nat Cell Biol， 2004，(11):872-883.

　　［2］ Elston CW， Ellis IO. Pathological prognostic factors in breast cancer I. The value of histological grade in breast cancer:Experience from a large study with longterm followup［J］. Histopathology，1991，19(5):403-410.

　　［3］ Rojo M， Legros F， Chateau D， et al. Membrane topology and mitochondrial targeting of mitofusins， ubiquitous mammalian homologs of the transmembrane GTPase Fzo［J］. Cell Sci， 2002，115(8):1663-1674.

　　［4］ Eura Y， Ishihara N， Yokota S， et al. Two mitofusin proteins， mammalian homologues of FZO， with distinct functions are both required for mitochondrial fusion［J］. J Biochem，2003，134:333-344.

　　［5］ Santel A， Frank S， Gaume B， et al. Mitofusin1 protein is a generally expressed mediator of mitochondrialfusion in mammalian cells［J］. Cell Sci， 2003，116(13):2763-2774.

　　［6］ 王萍，毋丽娜，蒋春笋，等. 人增殖抑制基因(HSG)对肿瘤细胞系化疗敏感性的作用［J］. 北京大学学报（医学版）， 2005，37(2):117-120.

　　［7］ Karbouski M， Lee YJ， Gaume B， et al. Spatial and temporal association of Bax with mitochondrial fission sites，Drpl and Mfn2 during apoptosis［J］. J Cell Biol，2002，159(6):931-938.

　　［8］ 李俐，王剑明，陈光慧，等. Mfn2基因对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的促进作用及其机制［J］. 华中科技大学学报（医学版），2007，36（1）57-59.

　　［9］ 夏耘，吴亚群，张林，等. 线粒体融合素基因2对人乳腺癌MCF7细胞株增殖与化疗敏感性的影响［J］. 癌症，2007，26(8):815-819.