组织工程技术的分析进展和国际规范

【关键词】 组织工程；风险；规范
　　0引言
　　自20世纪80年代以来，随着分子、基因和细胞生物学的发展，一项以细胞和组织工程技术为主的再生医学出现了，迅速成为世界各国的热门研究课题，目前已在皮肤、骨、软骨、心瓣膜、角膜、泌尿系、神经、牙齿、肌腱等十几个领域开展了广泛的研究，部分已形成产品，投入临床应用，比如美国FDA批准生产的Apligraf组织工程化皮肤等. 但任何一种新事物的出现都有利弊，在全世界一片叫好声中，也有一部分科学家和一些机构对此提出担忧，建议要及早规范组织工程研究领域. 我们就组织工程的研究进展及可能存在的问题作一综述.
　　1组织工程技术的研究进展
　　1.1组织工程的基本技术或方法形成组织器官至少有3个关键因素： 细胞、细胞外基质和生长因子. 因此，Tabata［1］指出，要形成组织工程化器官起码需要4种基本技术或方法. 首先最关键的是制备有利于细胞增殖和分化的人工支架材料替代细胞外基质. 细胞外基质对细胞不仅起物理支持作用，还提供细胞生长、增殖和分化的天然环境. 支架材料要求有： ① 良好的生物相容性；② 良好的生物降解性；③ 具有立体多孔结构和表面性能，增加细胞附着和生长空间；④ 有合适的机械强度，以利于维持组织器官的外形. 第二个关键技术是药物传输系统（drug delivery system， DDS）. 细胞能高效的增殖和分化，以及诱导新生血管的生成，DDS可以发挥重要作用. 因为组织工程化器官植入体内后，早期融入的生长因子等生物信号分子迅速被蛋白水解酶等分解，DDS通过缓释球、基因转染(病毒或非病毒载体)［2］等技术控制其缓慢释放或持续释放，可以长效地发挥作用. 已有实验证实利用DDS技术成功地导入BMP2，TGFβ1，bFGF，HGF等生长因子，促进了骨、软骨和血管的再生［3］. 第三是干细胞的体外分离和培养. 干细胞来源主要有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞、神经嵴干细胞、人脐血干细胞、外胚间充质干细胞等. 胚胎干细胞因受材料来源和道德约束，研究受到限制. 骨髓间充质干细胞和人脐血干细胞因取材方便、损伤小、来源广泛而日益受到重视［4］. 第四是应用物理屏障保护植入细胞和支架免受机体免疫反应的破坏及纤维结缔组织的入侵. 一种水凝胶生物膜（引导组织再生膜）可以阻止纤维的长入，更为关键的是，这种膜可以隔绝来自机体细胞免疫和体液免疫带来的反应，该反应可以杀伤植入的干细胞，影响组织的再生［1］.
　　1.2组织工程技术的意义和前景为什么组织工程技术一经提出就引起人们的极大兴趣，最主要的是它对人类有关疾病的治疗提供了一种全新的思路和方法，是治疗上一种新的理念. 这个理念就是组织工程可以利用机体有分化潜力的细胞在合适的条件下分化和增殖，从形态和功能上真正修复因疾病和创伤带来的组织缺损或功能障碍，而后者单靠机体本身或其他传统治疗方法目前是不可能完成的. 在近20年内，组织工程技术已在多个方面体现出价值. 第一，目前比较成功的是皮肤的研究和应用. 皮肤损伤在某种程度在上是可以自身修复的，但修复的同时一般都伴有不同程度的纤维增生，出现各种瘢痕，外形和功能上出现差异. 还有很多情况下，皮肤是不可能修复好缺损的，如深度和大面积烧伤、长期卧床引起的褥疮、糖尿病常见的足部溃疡等，组织工程化皮肤可以完成这些使命，美国已经有该类产品通过FDA认证并应用［5］. 第二，众所周知，神经系统尤其是脑和脊髓等中枢神经损伤是难以修复的，外周神经损伤修复能力也有限，而且损伤的功能障碍又相当严重，组织工程技术可以用引导管和生长因子等及时有效地刺激神经生长［6］，更有意义的是脑组织退化或病变等疾病如帕金森综合征，也可列入其研究目标. 第三，还有大部分非感染性疾病和非癌性疾病，尤其是先天性或外伤性组织缺损、组织退行性变和代谢性疾病等，组织工程都有可能实现组织再生. 总之，组织工程潜在的临床意义巨大，也很有吸引力. 如果这种再生医学能够投入应用，就很大程度上给我们提供一种新的治疗方法，同一疾病治疗选择的机会就更多，治疗效果可能更好. 如通过组织工程实现损伤组织所需关键细胞的植入和血管化的加速，修复或替代组织就成为可能，即使患有糖尿病或高脂血症等［7］.
　　2组织工程技术问题
　　2.1组织工程技术的研究难题尽管组织工程有巨大的潜力和优势，但必须清醒地认识到这是一个极其复杂的工程，包括种子细胞的来源、细胞的增殖和分化、细胞因子的应用、支架材料的选择、组织器官的表达和植入、机体的反应、组织的成活和远期疗效等，以及相关的道德伦理和法规等（将在后面的部分单独讨论），目前很多还是研究的初步阶段. 第一，关于种子细胞来源，主要有3个： 动物、其他人类供体、患者本人. 动物来源属异源基因，可能会引起免疫排斥和传播疾病，已经不考虑用于人类，主要用于科学研究；其他人类供体属同源基因，可以来源于成人、胎儿和胚胎的干细胞，通过培养和分化制备细胞银行或细胞库（cell bank）储备待用，但目前胚胎干细胞的获取和应用在很多国家受到法律和道德约束，而且干细胞及其子代细胞的鉴定、定向诱导、体外有效扩增和保存技术等仍不成熟，应用受到限制；自体干细胞的提取、分化和培养等研究目前初显成效，已经可以让软骨细胞产生软骨、成骨细胞产生骨质、神经胶质细胞产生神经、肌细胞产生肌肉等，但如何保证体外干细胞定向扩增和分化直至形成具有一定解剖结构的器官，在理论和实践上都相当困难［4］. 第二，细胞的增殖和分化在体内是一个多因子和多因素共同参与的复杂过程，在体外只能部分模拟生物环境. 目前有学者在摸索构建一种有效的生物反应器，模拟细胞生长所需的营养、代谢、微动力环境，有望高效地促进细胞增殖和分化. 此外诸多生长因子，如BMP，TGF，EGF，IGF，PDGF等复合到组织工程产品中，早期对细胞和组织的形成都有一定的促进作用. 虽然部分因子得到纯化和克隆，主要的功能也有所了解，但各因子更多的作用机制及其相互间促进和抑制效应尚不清楚，在体外和体内构建组织工程器官时还不敢大胆应用［8-9］. 第三，支架材料也是组织工程的核心部分，研究发现可用的材料有两大类：天然生物衍生的和人工合成的. 但至今没有一种完全符合要求，主要问题在材料的强度、多孔性、降解速度、产物和表面性能等. 为克服单一材料的性能不足，多种复合材料已经在大量合成和研究，有的还加入生长因子等，有了较大进步［9-10］. 随着计算机技术和制造技术的发展，利用快速成形工艺制作出仿生支架材料，已取得部分成功. 第四，组织工程化器官能否最终成功，很大部分与血管化有关. 细胞生长所需的营养来源于血供，目前还局限于体外的培养液和植入体内后的周边组织渗液，不能满足需求，尤其是构建大块组织时，中心必须有足够的血供，而这也正是目前阻碍组织工程研究快速发展的瓶颈. 探索的方法有： 将血管内皮细胞培养，结合VEGF，FGF，BMP等促血管生成因子，选择钙磷陶瓷或胶原支架等直接生成血管. 或通过被膜包裹法、显微外科法等引入外源血管. 但这些都只有初步结果，还没有一种简洁和有效的办法. 故构建大块或功能完整的器官似乎遥遥无期［11-13］. 第五，组织工程化产品植入体内也相当复杂，如心瓣膜是循环系统的中枢，组织工程产品因不能保证免疫排斥等反应，还不敢替代人工瓣膜；骨组织化产品支架强度和降解性等性能也不足以无需辅助固位就直接植入等；植入过程的损伤、炎症、免疫、血管生成等结论尚不成熟；此外，植入组织还涉及体内环境下变性和变量的控制，以及功能再替代等问题.
　　2.2组织工程技术的风险有人认为组织工程似乎有点过热、乐观得太早. 从商业角度讲，投资公司已经感觉到投资与回报不相称，大量的资金并没有预期的盈利效果，目前仅皮肤等小部分产品上市，专利技术也不多，研究结果始终处于初级阶段，影响下一步的投入，也必然影响组织工程研究的良性发展. 从患者的角度讲，组织工程技术和产品也面临信誉度的问题，人们可能考虑较大的应用风险和昂贵的费用问题，如果失败，还能不能行其他治疗方法？费用能不能退还？等等. William［14］总结了组织工程可能存在以下风险： ① 与异源基因有关的供体材料可能带来的微生物学的污染，如潜在的病毒感染；② 可能引起像癌、血液病、基因病等相关疾病的传播；③ 与产品生产过程相关的污染；④ 在联合培养过程中可能会掺入额外细胞形成产品并植入；⑤ 可能会把自体细胞培养的组织错误地植入受体；⑥ 在涉及基因操作时，细胞的扩增或分化可能会变异；⑦ 组织工程支架材料本身，及其与细胞的相互作用结果尚不明确，植入后对再生组织和机体的反应风险很大，因为我们并没有完全理解这种特殊的生物相容性. ⑧ 如何对这种有细胞、材料和活性成分的组织化产品消毒；⑨ 产品的冷冻保存后、生产添加剂和其它残余物等潜在的毒性，以及特殊患者的不良反应，如对抗体或其它物质过敏等问题；⑩ 组织工程化最终产品力学或生理学性能可能达不到完全符合生理需要，有的甚至可以致命，如组织工程化血管或心瓣膜.
　　欧盟在2003年也讨论了组织工程的风险，主要集中在产品的致癌性、感染性和人们接受的程度.
　　3对组织工程技术的规范
　　每一项治疗人体疾病的方法都必须对其安全性引起足够重视，虽然早就有细胞、基因、器官和材料等应用于人体的各种治疗，但因组织工程是一种新生事物，尤其是可以视为一种“产品”，涉及的领域广泛、过程复杂、技术不成熟等，世界各国都比较重视，呼吁有一个行业调节规范. 最早的有美国、澳大利亚、加拿大，稍后有日本，欧盟近来也在加紧讨论和制定规范［15］. ① 美国： 美国法律规范里，1993年就有关于细胞治疗问题，1996年FDA公布了活体同源细胞应用指南，1997年初步提出与细胞和组织相关的规范，并于2001年正式确定规范，要求细胞和材料的安全性及质量生产过程等必须严格按GMP规范执行. 到了2002年，为应对组织工程多种复合结构的变化，FDA成立了一个特别的复合产品办公室(office of combination products)，负责产品的监管调节. 按照产品的首要运用法则（primary mode of action）执行，如果组织工程产品（tissue engineering product，TEP）的主要成分与直接的生理活动有关，就由生物制剂评估和研究中心(center for biologics evaluation and research，CBER）监管；如果TEP是通过结构和生理学方式生效的，像器官置换一类的支撑系统，就由设备和放射健康中心（center for devices and radiological health，CDRH）监管；后来又把一部分监管工作调整到药物评估和研究中心（center for drug evaluation and research，CDER）. 因此，所有包含有细胞、生物材料和生物制剂（细胞因子、生长因子、免疫调节因子、酶等）的TEP，都要接受这3个中心的监管和评价，根据产品的主要点选择以哪个中心评价为主，有争议的根据情况再协商，但必须保证产品安全. ② 加拿大：200301加拿大颁布了有关人体细胞、组织和器官移植的规范，这个规范遵循了加拿大标准协会的全国安全标准准则，已被执行得相当好. 但这个规范主要针对的是直接人体细胞和组织的植入，而不完全是TEP，后者包含有细胞、组织或器官的复制、改性、保存，以及临床实验等复杂过程，因而还要通过食品和药品器械管理机构评价［16］. ③ 日本： 日本目前已经允许皮肤和软骨产品按医疗器械进行临床实验，但2002年修正的药物法（pharmaceutical affairs law，PAL）提出可能要把所有关于细胞和组织的产品都归于生物制品，新法确立异源性产品属高风险的特定生物制品，自体源性产品属主流生物制品. 日本卫生、劳动和福利部（ministry of health， labour and wealth， MHLW）旨在将细胞和组织工程产品归类于传统的生物制品以便于进行安全监管，因为此时就需要严格地执行GMP标准. 但也有个问题就是，进入市场的产品从细胞分离、纯化、分化、浓缩、运输等都可能执行GMP标准，而对在医院术中应用成体干细胞制备组织工程产品过程的监管就困难得多. MHLW在1999年就发出了关于细胞和组织工程产品的通告，2000年又进一步标准化，随后又积极地参与国际协调委员会的讨论、参照美国FDA的标准，故仍有普遍意义. 日本正视异源性产品的风险，控制使用，保证安全. 但也声明对实验研究不执行如此严格要求. 对胚胎干细胞（ESC）的提取和应用只能限于基础研究，临床研究和医学应用必须等明确的规范条文出台后才能进行，但允许利用ESC发展诊断和治疗方法. 从事ESC研究的机构需获得相关执照，ESC及相关材料只能从这些机构或从国家认可的国外公司获得.

根据PAL的规定，日本的许多公司已经意识到成体干细胞（somatic stem cells）属于医疗器械类，只要不用血清培养技术就符合要求，而且临床前和临床规范也不同于ESC，可以较容易进入市场，成体干细胞已经应用于整形外科、牙科和神经再生等. 为避免出现问题，也许日本将来会按ESC要求规范成体干细胞移植. ④ 澳大利亚：澳大利亚的治疗性产品管理局（therapeutic products agency，TPA）在1989年治疗规范基础上，于1995年增加了人体组织应用条款，2000年修正. 200304 TPA又组织了一个研讨会，制定了新的人体组织和生物治疗规范，并把组织工程产品分类为小风险、中度风险和高度风险，中度风险产品按GMP要求执行，高度风险产品严格控制，须上报获准. ⑤ 欧盟： 目前对于组织工程产品这个涉及人体活细胞再植入问题的新生事物，欧盟各国还没有达成一致意见，暂时套用的指南有2000/70/EC（针对医疗器械）、2001/83/EC修正文、2003/83/EC（针对某些细胞治疗产品）等，最新的有2004/23/EC，是一个关于人体和细胞捐献、获取、测试、处理、保存、储运、使用等质量和安全性的指南，该指南对组织工程前阶段相关细胞等方面尚有意义，但对后阶段及涉及异种细胞等方面规范仍是一个空白. 2003年底，欧盟各国在芬兰组织了一个由政府官员、组织工程专家、医学专家、开发商等人组成的专题研讨会，主题是： 组织工程有关的科学与技术；组织工程的生物学风险；关于组织工程商业方面；组织工程的规范. 大家一致认为既往的规范不全面，有的把组织工程简单地归于医药或器械产品，虽然也是按GMP执行，但考虑到组织工程的高风险性和不确定性，欧盟国家应该建立一个有关TEP的统一规范条文，包括实验室、投资公司、患者、医疗机构，从科研、生产到应用等各方面加强与美国等交流合作，借鉴经验，先在内部形成统一，以占领市场［17］.
　　4结语
　　组织工程技术从原理和途径上讲都是可行的，是对再生医学的发展，而且会伴随着基因工程的研究进展而发展. 尽管有不同的意见，但出发点都是为了促进组织工程的发展，有了规范，在理性条件下该技术将发展更快.

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