作者：段钢 朱自强 陈宏亮 戈兵
【摘要】 目的 探讨脂多糖(LPS) 促进人工关节松动的可能性。方法 采集30例人体外周血，分离单核细胞(MOs)，分组培养。实验分4组（n=30）：A组(对照组)仅加入MOs;B组加入MOs+LPS（100 μg/L），C组加入MOs+超高分子聚乙烯微粒(UHMWPE);D组加入MOs+UHMWPE+LPS（100 μg/L）。培养48 h后，放免法测定上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)的含量。结果 D组TNF-α和IL-6水平分别明显高于A、B、C组(P＜0.05);B组与C组之间TNF-α、IL-6水平差异无统计学意义(P&>0. 05)。结论 LPS 能有效地刺激MOs分泌TNF-α、IL-6，效果与UHMWPE相似，且具有促进UHMWPE刺激TNF-α、IL-6分泌的作用，增强了UHMWPE的溶骨效应。
【关键词】 脂多糖;人工关节；磨屑;假体失败;骨溶解
Abstract: Objective To explore the possibility of lipopolysaccharide (LPS) contributing to aseptic loosening of orthopedic implants. Methods 30 samples of peripheral blood were obtained from healthy human donors. Monocytes (MOs) were isolated and assigned to 4 groups （n=30 each） for culture. Group A was treated with MOs alone; group B with MOs+LPS (100 μg/L); group C with MOs+ultrahigh molecular weight polylethylene (UHMWPE) debris; group D with MOs+UHMWPE+LPS (100 μg/L). The cells were co-cultured for 48 h and the supernatant was tested for TNF-α and IL-6 content with radioimmunoassay. Results The levels of TNF-α and IL-6 were much higher in group D than in the other 3 groups. There was no significant difference in TNF-α and IL-6 levels between group B and group C (P&>0.05). Conclusion LPS effectively stimulates MOs to secrete TNF-α and IL-6. LPS is not only similar to UHMWPE in action， but also promotes UHMWPE to stimulate the secretion of TNF-α and IL-6， therefore enhancing the osteolytic effect of UHMWPE.
Key words: lipopolysaccharide; artificial joint; wear debris; prosthesis failure; osteolysis
人工关节的无菌性松动是影响关节置换术后远期疗效的主要因素［1］。在无菌性松动的假体周围可以看见骨质有明显的溶解现象，使其支撑结构破坏，致使假体松动［2］。近年来，越来越多的临床实践表明，脂多糖(LPS)可黏附多种人工假体材料并刺激细胞产生肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素6(IL-6)等溶骨性因子［3］，从而促进骨溶解。本实验通过人外周血单核细胞（MOs）、超高分子聚乙烯微粒(UHMWPE)和LPS的混合培养，探讨LPS对人工关节松动的促进作用，为揭示人工关节无菌性松动提供理论与实践依据。
1 资料和方法
1.1 主要试剂
LPS（E.coli.055:B5，Sigma公司），RPMI 1640细胞培养液(GBCO公司) ，聚蔗糖-泛影葡胺分层液(FICOLL，上海试剂厂，沪Q/H G22222043289)，小牛血清(特级，杭州四季青公司)，六孔培养板(GBCO公司)，TNF-α ELISA试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免研究所，最小检测浓度＜0.3 μg/L)，IL-6 ELISA试剂盒(R&&D公司)。
1.2 样本采集
随机选择健康献血者30例，其中男18例，女12例，年龄40～70岁，平均52.6岁。每例受试者采集外周血10 ml，肝素抗凝。
1.3 实验方法和分组
采集的外周血以Hank液稀释1倍，分层液梯度离心法分离出MOs。洗涤3 次，加含10%小牛血清的RPMI 1640培养液制成细胞悬液，细胞计数，调整细胞浓度至4×108/L，锥虫蓝排除法检测细胞活力均大于95%。向培养板中滴加细胞悬液，每孔加3 ml。置37℃、5%CO2恒温恒湿培养箱培养4 h，使细胞贴壁，利用MOs的贴壁性洗去非贴壁细胞，留下MOs。每板第1孔加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养液3 ml，于第2孔中加入100 μg/L的LPS悬液3 ml，余2孔中加入浓度为1012/L的UHMWPE悬液3 ml，于第4孔加入LPS使其浓度为100 μg/L。即第1孔为仅有MOs的空白对照组(A组)，第2孔为MOs+LPS 100 μg/L(B组)，第3孔为MOs+UHMWPE(C组)，第4孔为MOs+UHMWPE+LPS 100 μg/L(D组)。混匀，相同条件培养48 h后将细胞及液体混合物离心后取上清液，离心后放免法测定上清液中的TNF-α、IL-6含量。
1.4 统计学处理
数据以±s表示，组间比较采用方差分析(ANOVA)和两两比较的q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
4种不同处理组上清液中TNF-α、IL-6的含量见表1，方差分析提示4组细胞上清液中TNF-α、IL-6含量差异有显著性(P＜0.05)。两两比较显示:B、C、D组TNF-α、IL-6含量均明显高于A组(P＜0.05)，B、C组TNF-α、IL-6含量差异无统计学意义(P＞0.05)，说明LPS和UHMWPE均可增强MOs分泌TNF-α、IL-6，效果相似；D组TNF-α、IL-6含量均明显高于B、C组(P＜0.05)，说明LPS具有促进UHMWPE诱导MOs分泌TNF-α、IL-6的作用，增强了溶骨效应。表1 不同处理组TNF-α、IL-6的含量(略)
3 讨 论
人工关节置换术是治疗严重关节疾患的有效方法之一。但是，随着人工关节置换数量的增加以及人工关节使用年限的延长，人工关节的无菌性松动成为影响其远期疗效的主要原因。超过66%的髋关节翻修和近50%的膝关节翻修由人工关节无菌性松动引起［4］。目前多数研究认为各种磨损碎屑活化假体周围界膜中的巨噬细胞、异物巨细胞等细胞释放IL-6、IL-1及TNF-α等骨吸收因子，溶骨性因子直接或间接地激活破骨细胞，从而引起假体周围骨吸收、骨溶解，后者又可加重磨损，产生更多的微粒，形成恶性循环，使假体周围支撑骨量丢失，最终导致人工关节的无菌性松动。
在生物性因素方面，磨损颗粒是无菌性松动发生的关键性因素［2］。然而，随着对无菌性松动的生物学机制研究的逐渐深入，LPS在加速人工关节的无菌性松动方面的作用逐渐引起重视。LPS是革兰阴性细菌所共有的细胞膜成分，具有与磨损颗粒相似的生物学作用，可刺激细胞产生TNF-α、IL-1、IL-6［5］，这些因子正是导致了人工关节无菌性松动的主要原因，并且LPS易黏附于多种人工假体材料及其磨损颗粒，如钛、钛合金、聚乙烯等［3，6～8］。Tatro等［9］发现在UHMWPE导致的骨溶解的鼠模型中有内毒素的积聚现象，其主要成分是LPS。在许多没有临床感染表现的松动假体上，常可发现革兰阴性菌细胞膜成分［10］。因此磨损颗粒引起的炎性介质释放、骨溶解及骨吸收等可能与其黏附的LPS密切相关。
本实验通过在体外将人外周血MOs、UHMWPE、LPS进行共同培养，应用ELISA检测TNF-α、IL-6含量，发现B、C组含量明显高于A组(P＜0.05)，说明UHMWPE、LPS均可刺激MOs分泌溶骨因子TNF-α、IL-6； B、C组之间TNF-α和IL-6含量差异无统计学意义(P＞0.05)，提示在一定的剂量范围内LPS刺激MOs分泌溶骨性因子TNF-α、IL-6的作用与UHMWPE类似；D组TNF-α和IL-6含量明显高于B、C 组(P&<0.05)，证明LPS具有促进UHMWPE诱导MOs分泌TNF-α、IL-6的作用，二者具有协同作用，增强了溶骨效应。
本实验结果亦提示LPS具有促进UHMWPE刺激TNF-α、IL-6分泌的作用，在人工关节无菌性松动方面起着重要作用，为人工关节无菌性松动的预防和治疗提供了新的思路。当然，本实验仅仅是体外的初步研究，还有待于进一步的动物实验和临床研究证实。
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