作者：程晓刚 叶琬 邹强 陈玮 金虹 徐艳 张绍兰 冷言冰 李晋川
【摘要】 目的 克隆人白细胞介素27（interleukin 27，IL-27）蛋白亚基EB病毒诱导的基因3（Epstein-Barr virus-induced gene 3，EBI3)与p28基因的cDNA，分别构建其真核表达质粒并在COS-7细胞表达。 方法 人外周血单核细胞诱导为成熟树突状细胞后提取细胞总RNA，经逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）扩增EBI3与p28基因cDNA，酶切后插入pcDNA-3.1 构建真核表达载体pcDNA-EBI3与pcDNA-p28。重组质粒转染COS-7细胞，RT-PCR检测目的基因表达。结果 成功构建克隆人IL-27蛋白亚基真核表达质粒，重组质粒分别转染COS-7细胞后检测到相应基因表达。结论 人IL-27蛋白亚基基因克隆及真核表达质粒的成功构建，为构建表达有生物学活性的重组人单链IL-27蛋白奠定基础。
【关键词】 IL-27；基因克隆；真核表达
Abstract: Objective To clone and construct the eukaryotic expression plasmids containing human IL-27 protein subunits and investigate their expression following transfection into COS-7 cells. Methods Total RNA was extracted from dendritic cells derived from human peripheral blood monocytes for cloning EBI3 cDNA and p28 cDNA by RT-PCR. The eukaryotic expression plasmids pcDNA-EBI3 and pcDNA-p28 were constructed and transfected into COS-7 cells， where the expressions of target gene were detected by RT-PCR. Results The IL-27 protein subunits cDNA were cloned and the constructed plasmids were verified to be correct by sequencing. Target gene expressions were detected by RT-PCR in the transfected COS-7 cells. Conclusion The eukaryotic expression plasmids containing human IL-27 protein subunits were constructed and expressed in COS-7 cells successfully. This work paves the way for construction and expression of the bioactive single chain human IL-27 protein.
Key words: IL-27； gene clone； eukaryotic expression
细胞因子白细胞介素27（interleukin 27，IL-27）［1］是近年来发现的由EB病毒诱导的基因3（Epstein-Barr virus-induced gene 3，EBI3)与p28蛋白构成的异二聚体蛋白，EBI3为近年来发现的由EB病毒诱导的恶性肿瘤所表达的蛋白［2］，EBI3在体内与p28蛋白结合形成的细胞因子IL-27具有重要的免疫调节功能。实验表明IL-27可诱导童贞T细胞Th1极化，促进T细胞和自然杀伤(NK)细胞分泌IFN-γ而促进细胞免疫应答，因而可诱发特异性的抗肿瘤免疫［3］。本研究旨在克隆人IL-27蛋白亚基EB病毒诱导的基因3（EBI3）与p28基因的cDNA，构建真核表达质粒pcDNA-EBI3与pcDNA-p28并在COS-7细胞表达，为构建与表达有生物学活性的单链重组人IL-27蛋白奠定基础。
1 材料和方法
1.1 质粒和菌株 真核表达质粒pcDNA3.1(+)（5.4 kb) 、大肠杆菌E.coli DH5α菌株、非洲绿猴肾细胞COS-7为本室保存。
1.2 主要试剂和器材 载体连接试剂盒、限制性核酸内切酶、DNA凝胶回收试剂盒、PCR试剂购自Takara公司，质粒抽提试剂盒购自Omega公司，Trizol为Invitrogen公司产品，RevertAidTM cDNA第一链合成试剂盒为Fermentas公司产品，DOTAP脂质体转染试剂盒为Roche公司产品，rmIL-4与rmGM-CSF蛋白购自Cytolab公司。细胞生长液RPMI 1640培养基为GIBCO BRL公司产品，新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，单核细胞分离液为成都豪乙生物科技有限公司产品，其他试剂为进口或国产分析纯。
1.3 引物设计 据文献报道基因序列设计引物：EBI3上游引物(P1)：自EBI3起始密码ATG 起始， 5′端含HindⅢ酶切位点P:5′CCCAAGCTTATGACCCCGCAGCTTCTCCT 3′，EBI3下游引物(P2)：自终止密码TAG开始，5′端含EcoR V酶切位点，5′CGATATCCTACTTGCCCAGGCTCATTG 3′。 p28上游引物(P3)：自p28起始密码ATG开始，5′端加入Hind Ⅲ酶切位点，5′CCCAAGCTTATGGGCCAGACGGCAGGCGA 3′，p28下游引物(P4)：自终止密码TGA开始，5′端加入EcoR Ⅴ酶切位点，5′GGATATCTCAGGGCTGGGGGCTCAATG3′。上述引物由上海博亚生物技术有限公司合成。
1.4 pcDNA-EBI3与pcDNA-p28质粒的构建 分离人外周血单核细胞，细胞密度为5×108/L，经rmGM-CSF(100 μg/L)与rmIL-4(100 μg/L)诱导7天后经LPS（1 mg/L）刺激6 h后，收集诱导成熟的树突状细胞，提取细胞总mRNA，按Fermentas公司提供的cDNA第一链合成说明进行逆转录反应获得cDNA，随之进行聚合酶链反应(RT-PCR)获得EBI3与p28基因编码序列的cDNA，反应条件：95℃1 min，进入循环，94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min 。取RT-PCR 产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，将扩增产物经Hind Ⅲ与EcoR Ⅴ酶切，插入上述酶切线性化的pcDNA-3.1(+)载体， 连接后转化DH5α感受态菌，培养后挑取白色单菌落，小量提取质粒DNA 进行酶切鉴定，命名为pcDNA-EBI3与pcDNA-p28，并送至上海鼎安生物科技有限公司进行插入DNA序列测定。
1.5 重组质粒的细胞转染与表达 对数生长期COS-7细胞培养于RPMI 1640培养液中，将2×105个细胞接种于6孔板培养24 h，待细胞生长至70％~80％融合时，采用Roche公司的DOTAP脂质体转染试剂盒包裹重组质粒，按照试剂使用说明转染细胞，10 h后弃去转染液，换新鲜培养基继续培养48 h，分别收集实验孔及阴性对照、空白对照孔的细胞，提取细胞总RNA，RT-PCR检测细胞EBI3与p28基因表达。
2 结 果
2.1 人外周血单核细胞细胞诱导成为树突状细胞 分离正常人外周血单核细胞，经rmGM-CSF(100 μg/L)与rmIL-4(100 μg/L) 诱导后第7天发育为树突状细胞，细胞体积明显增大，呈集落贴壁生长，并有树枝状突起。经LPS（1 mg/L）刺激12 h后，细胞表面突起明显，树突状细胞发育成熟（图1）。
图1 人外周血单核细胞经IL-4与GM-CSF
诱导7天后成为树突状细胞
2.2 RT-PCR扩增人EBI3与p28基因 取LPS刺激的树突状细胞总RNA，进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下可见3条清晰条带，分别为5S、18S、28S。将RT－PCR产物分别进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，可见2条亮带，大小分别约710 bp和750 bp，与EBI3与p28基因cDNA片断预期大小相符（图2）。
图2 人EBI3与p28 基因cDNA扩增结果
1. EBI3基因cDNA RT-PCR产物；2. p28基因cDNA RT-PCR产物；M. DL2000 DNA marker2.3 pcDNA-EBI3与pcDNA-p28真核表达质粒的构建 经Hind Ⅲ与EcoR Ⅴ双酶切后的人EBI3 cDNA与p28 cDNA的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收后与上述酶酶切后的pcDNA3.1进行定向连接，连接后转化DH5α感受态菌。抽提质粒，进行Hind Ⅲ与EcoR V双酶切鉴定，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳结果与预期相符，DNA测序结果与EBI3和p28cDNA序列一致（图3、4）。
2.4 重组质粒在COS-7细胞中的表达 分别收集未转染、pcDNA-EBI3、pcDNA-p28与空载体pcDNA3.1转染的COS-7细胞，经逆转录得到cDNA模板进行PCR扩增。结果表明，从重组质粒转染的COS-7细胞中可分别扩增出EBI3基因与p28基因，而空质粒转染和未转染细胞中未扩增出目的条带（图5）。
图3 pcDNA-EBI3与pcDNA-p28真核表达
质粒酶切鉴定结果
M. DL2000 DNA marker；1. pcDNA3.1/Hind Ⅲ+EcoR Ⅴ；2. pcDNA3.1； 3. pcDNA-EBI3/Hind Ⅲ+EcoRⅤ；4. pcDNA-EBI3； 5. pcDNA-p28/Hind Ⅲ+EcoRⅤ；6. pcDNA-p28
图5 重组质粒转染COS-7细胞中目的
基因的RT-PCR检测
1. 未转染/p28引物扩增；2. pcDNA3.1转染/ p28引物扩增；3. pcDNA-p28转染/p28引物扩增；M. DL2000 DNA marker；4. pcDNA-EBI3转染/EBI3引物扩增；5. pcDNA3.1转染/EBI3引物扩增；6. 未转染/EBI3引物扩增3 讨 论
IL-27(EBI3-p28)［1］是近年发现的IL-12超家族的新成员，IL-27是由IL-27 p28和IL- 27 EBI3（EB病毒诱导的基因3蛋白［2］、Epstein-Barr virus-induced gene 3、EBI3）两亚基构成的异源二聚体。IL-27表达主要限于髓细胞系，主要由LPS等活化的单核细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞产生。其受体为WSX-1/TCCR（T细胞的细胞因子受体、T-cell cytokine receptor）和gp130构成的异源二聚体［4］，主要表达于人淋巴组织如胸腺和脾脏和外周血淋巴细胞尤其是CD4(＋)T细胞和NK细胞表面。实验表明，TCCR/WSX1活化对启动Th1极化有重要作用［5］。提示IL-27在诱导T细胞分化为Th1的过程中起重要作用，并可增强细胞介导的免疫反应。实验表明肿瘤局部表达IL-27可产生细胞依赖性和非依赖性的抗肿瘤反应［3］，因此IL-27有潜在的临床应用价值。
正常的未被激活的静止的抗原递呈细胞存在有IL-27亚基的低水平转录。本实验中我们采用LPS活化诱导后的树突状细胞使其高表达EBI3与p28 mRNA，LPS活化后的6 h和12 h均检测到树突状细胞EBI3与p28的表达，并采用RT-PCR的方法合成了EBI3与p28cRNA。根据载体的序列特点，合成PCR引物时，在引物的5′端引入相应的限制性内切酶酶切位点，这样合成的cRNA只需用适宜的限制性内切酶消化后即可产生有效的定向连接末端，便于与酶切后的载体连接，实验直接将cRNA与目标载体连接，省去T/A克隆，使实验过程更加简便快速。
本实验所克隆的EBI3 与p28编码序列的cDNA 序列与文献报道一致，构建的pcDNA3.1/EBI3 与pcDNA3.1/EBI3质粒阅读框架正确， 构建质粒转染COS-7细胞成功检测到EBI3与p28基因的表达，本实验为进一步构建与表达具有生物学活性重组人单链IL-27蛋白奠定了基础。
参考文献
［1］ Pflanz S， Timans JC， Cheung J， et al． IL-27，a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein， induces proliferation of naive CD4(+) T cells ［J］ ．Immunity，2002，16(6)：779-790．
［2］ Larousserie F， Bardel E， Pflanz S，et al． Analysis of interleukin-27 (EBI3/p28) expression in Epstein-Barr virus and human T-cell leukemia virus type 1-associated lymphomas： heterogeneous expression of EBI3 subunit by tumoral cells ［J］． Am J Pathol，2005，166(4)：1217-1228．
［3］ Chiyo M， Shimozato O， Yu L， et al． Expression of IL-27 in murine carcinoma cells produces antitumor effects and induces protective immunity in inoculated host animals ［J］．Int J Cancer，2005，115(3)：437-442．
［4］ Pflanz S， Hibbert L， Mattson J， et al． WSX-1 and glycoprotein 130 constitute a signal-transducing receptor for IL-27 ［J］．J Immunol，2004，172(4)：2225-2231．
［5］ Takeda A， Hamano S， Yamanaka A， et al． Cutting edge： role of IL-27/WSX-1 signaling for induction of T-bet through activation of STAT1 during initial Th1 commitment ［J］．J Immunol，2003，170(10)：4886-4890．