作者：王林军，张延斌，程仁力，周维东
【摘要】 目的 观察胰岛素增敏剂罗格列酮（rosiglitazone，RSG）对胰岛素抵抗高血压大鼠及两肾一夹肾血管性高血压大鼠血压的影响，探讨其作用机制。方法 用10%果糖水喂养雄性SD大鼠制备胰岛素抵抗高血压大鼠（insulin resistance hypertensive rat，IRHR）模型，同时用两肾一夹法制备肾血管性高血压大鼠（two-kidney， one-clipped renovascular hypertensive rat，RHR）模型，观察RSG对2组大鼠的降压作用，通过检测空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、空腹胰岛素（fasting serum insulin，FINS）、瘦素（leptin，LP）、甘油三酯（triglyceride，TG）及计算胰岛素敏感性指数（insulin sensitivity index，ISI）等指标，从胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）/高胰岛素血症（hyperinsulinemia，HIS）角度探讨RSG可能的降压机制。结果 RSG处理后IRHR组大鼠收缩压（systolic blood pressure，SBP）、FINS、LP和TG与处理前相比明显降低，ISI明显升高（P&<0.01），FBG无明显改变（P&>0.05）。RSG处理后RHR组大鼠与处理前相比SBP、FINS、LP、TG、ISI和FBG与RHR组相比无明显变化（P&>0.05）。结论 RSG可明显降低IRHR模型的血压而对RHR模型无明显降压作用。其机制主要通过改善IR/HIS以及高LP血症起降血压作用。
【关键词】 罗格列酮；胰岛素抵抗；高血压；胰岛素；瘦素；大鼠模型
Abstract: Objective To observe the anti-hypertensive effect of insulin sensitizer rosiglitazone (RSG) on the models of insulin resistance hypertensive rat (IRHR) and two-kidney， one-clipped renovascular hypertensive rat (RHR)， and to study the antihypertensive mechanism of RSG. Methods The model of IRHR was established by feeding standard fodder and 10% fructose water， while the model of two-kidney， one-clipped RHR was formed by constricting the left kidney artery. The anti-hypertensive mechanism of RSG was studied by examining the ratio of insulin resistance / hyperinsulinemia (IR/HIS) and by measuring systolic blood pressure (SBP)， fasting blood glucose (FBG)， fasting serum insulin (FINS)， leptin (LP)， triglyceride (TG) and calculating insulin sensitivity index (ISI). Results As compared with that in the IRHR group at the end of experiment， in the RSG treated IRHR group， the levels of SBP， LP， FINS and TG were decreased obviously， the level of ISI was increased obviously (P&<0.01)， but the level of FBG was not changed significantly (P&>0.05). When comparison was made between the two RHR groups， no significant changes were found in the levels of SBP， LP， FINS， TG， ISI and FBG after RSG treatment (P&>0.05). Conclusion RSG has an obvious anti-hypertensive effect on IRHR， but not on RHR. The results suggest the mechanism of anti-hypertensive effect of RSG is indirectly through the improvement of IR/HIS and high LP.
Key words: rosiglitazone; insulin resistance; hypertension; insulin; leptin; model of rat
近年来，通过临床和流行病学研究，人们逐渐意识到高血压（EH）并不单纯是血流动力学的改变，还常伴有糖耐量低减、高胰岛素血症（hyper-insulinemia，HIS）、血脂异常等代谢紊乱，称为胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）。研究表明EH人群约60%有IR，一些前瞻性研究提示HIS是致高血压的重要原因［1］，不难推测IR/HIS是高血压的发病基础之一，而改善机体胰岛素敏感性有可能成为防治IR/HIS人群高血压的有效措施。本实验通过建立胰岛素抵抗高血压大鼠（insulin resistance hypertensive rat，IRHR）模型及两肾一夹肾血管性高血压大鼠（two-kidney， one-clipped renovascular hypertensive rat，RHR）模型，观察胰岛素增敏剂罗格列酮（rosiglitazone，RSG）对2组大鼠的收缩压（systolic blood pressure，SBP），空腹胰岛素（fasting serum insulin，FINS）、瘦素（leptin，LP）等指标的影响，探讨RSG可能的降压机制。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
Sprague-Dawley（SD）大鼠67只，雄性，体重180～220 g，普通级，徐州医学院实验动物中心提供。
1.1.2 主要实验药品和试剂
马来酸罗格列酮片（批号：05110006）为葛兰素史克（天津）有限公司产品，结晶果糖购自北京广联行化工产品有限公司，大鼠胰岛素酶联免疫定量检测试剂盒（批号：0609083）及大鼠瘦素酶联免疫定量检测试剂盒（批号：0609084）均购自上海西唐生物制品有限公司。
1.1.3 主要实验仪器及设备
微量血糖仪及血糖仪试纸（美国罗氏公司），MacLab生理记录仪（澳大利亚ADI公司），全自动生化分析仪（日本Olympus公司），Thermo-Multiskan Mk3型酶标仪（芬兰雷勃公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组及处理步骤
首先，67只雄性SD大鼠分笼（每笼4～5只），置于温度（22±2）℃，光照12 h/24 h，普通饲料、自由饮水的环境中适应性饲养1周后进行实验。普通饲料由徐州医学院实验动物中心提供。
大鼠随机分为3组。空白对照组（control组，C组）16只，普通饲料+自来水喂养；胰岛素抵抗高血压大鼠组（IRHR组）24只，普通饲料+10%果糖水喂养；两肾一夹肾血管性高血压大鼠（RHR组）27只，行左肾动脉缩窄术（术中麻醉意外死亡2只、血管变异死亡1只，最后存活24只），术后普通饲料+自来水喂养。喂养4周后，大鼠禁食8～10 h，3组各随机抽取8只行颈动脉插管，测SBP及留取血标本后断头处死。指标检测证实造模成功后，进入第5周各组继续原来的饲养，从IRHR组及RHR组各随机抽取8只大鼠分别用RSG每日5 mg/kg灌胃，建立IRHR+RSG组和RHR+RSG组。RSG灌胃期间，为保持各组间的均衡性，其余各组大鼠均用等量的自来水灌胃。第8周末所有大鼠均禁食8～10 h后行颈动脉插管，测SBP及留取血标本后断头处死。
1.2.2 RHR模型的制备
参考文献
［2-3］。准备外径为0.20 mm的针灸针（长约10 cm）若干根，并消毒保存。大鼠经1%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉，俯卧位固定于操作台上。体外触及左侧肾脏，剪去局部3 cm×3 cm被毛，消毒铺巾。在触诊肾脏与脊柱之间沿与脊柱平行方向切开皮肤，切口1.5～2.5 cm。逐层分离皮下筋膜及肌肉到达肾脏，以盐水棉球推开肾周脂肪囊，用开睑器撑开充分显露手术视野，于腹膜后仔细分离肾动脉，用玻璃分针追查至肾脏，检查无误后，把直径为0.20 mm的针灸针与肾动脉血管长轴紧贴平行放置，用无菌丝线扎紧肾动脉和针灸针，然后小心抽去针灸针，这样左肾动脉血流就部分被阻断，形成左肾动脉狭窄。依次缝合肌肉和皮肤。术后3天内青霉素（3×104 U/d）腹腔注射预防感染。1.2.3 大鼠血压的测量
实验大鼠经1% 戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉，仰卧位固定于操作台上，体外触及气管软骨，剪去局部3 cm×3 cm被毛，消毒铺巾。在气管软骨左侧沿与气管平行方向切开皮肤，切口2～3 cm，逐层分离皮下组织及肌层，暴露左颈动脉鞘，将左颈动脉同迷走神经等结构分离，于左颈动脉下预置2 根缝线，远心端的缝线进行结扎，近心端用动脉夹夹闭，于近结扎线附近将预充有肝素的插管向近心端方向插入，松开血管夹，固定插管。插管尾部通过换能器连接MacLab生理记录仪可直接显示SBP。观察10～15 min，待血压稳定后记录SBP。
1.2.4 成模标准
IRHR模型的成模标准：依据Reaven［4］的报道，果糖喂养的SD大鼠TG、SBP、FINS的平均水平达到以下标准者，即：TG≥1.8 mmol/ L，SBP≥142 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），FINS≥正常对照组平均值的2倍者为IRHR模型。RHR模型的成模标准：依据赵清等［5］的报道，造模处理后凡血压比处理前高20 mmHg以上且高于140 mmHg者确认为高血压模型形成。
1.3 主要观测指标
大鼠SBP、FBG、FINS、LP、TG及计算ISI。大鼠颈动脉SBP用MacLab生理记录仪测量；FINS及LP用ELISA试剂盒测定；FBG以微量血糖测定仪测定；TG用全自动生化分析仪测定；ISI由公式：ISI=1/(FBG×FINS)计算得出（FBG、FINS的单位分别是mmol/L、mU/L），此值为非正态分布，计算时取其自然对数［6］。
1.4 统计学处理
采用SPSS 11.5软件进行统计分析，采用Sigma-Plot 10.0软件绘图。定量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间差异的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两因素之间的关系采用直线相关分析，P&<0.05认为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 IRHR及RHR模型的建立
实验第4周末，IRHR组的TG、SBP、FINS等指标均达到成模标准，提示IRHR模型成功建立；与C组大鼠相比，TG、SBP、LP和FINS明显升高，ISI明显降低（P&<0.01）， FBG无明显改变（P&>0.05）。RHR组的SBP达到成模标准，提示RHR模型成功建立；与C组大鼠相比，SBP明显升高（P&<0.01），而TG、LP、FINS、ISI和FBG均无明显改变（P&>0.05），见表1。表1 实验第4周末IRHR组、RHR组与C组大鼠各项指标的比较（略）
2.2 实验第8周末IRHR组、RHR组与C组大鼠各项指标的比较
实验第8周末，IRHR组的TG、SBP、FINS等指标提示IRHR模型成功维持；与C组大鼠相比，IRHR组的SBP、TG、LP和FINS仍明显升高，ISI明显降低（P&<0.01），FBG无明显改变（P&>0.05）。RHR组的SBP提示RHR模型成功维持；与C组大鼠相比，RHR组的SBP明显升高（P&<0.01），而TG、LP、FINS、ISI和FBG均无明显改变（P&>0.05）。见表2。表2 实验第8周末IRHR组、RHR组与C组大鼠各项指标的比较（略）
2.3 IRHR组SBP相关因素分析
在IRHR组中，SBP与FINS、LP和TG呈高度正相关，与ISI呈高度负相关，与FBG无相关性。见表3。表3 IRHR组SBP相关因素分析（略）
2.4 IRHR组血清LP相关因素分析
在IRHR组中，LP与SBP、FINS和TG呈高度正相关，与ISI高度负相关，与FBG无相关性。见表4。表4 IRHR组LP相关因素分析（略）
2.5 RSG干预前后IRHR组大鼠各指标的变化
RSG+IRHR组大鼠SBP、FINS、LP和TG与IRHR组相比显著降低，ISI明显升高，差别具有统计学意义（P&<0.01），而FBG无统计学差异（P&>0.05）。见表5。表5 RSG对IRHR组大鼠各指标的影响（略）
2.6 RSG干预前后RHR组大鼠各指标的变化
RSG+RHR组大鼠与RHR组相比SBP有下降趋势，但没有统计学意义（P&>0.05）；FINS、LP、TG、ISI和FBG与RHR组相比差别无统计学意义（P&>0.05）。见表6。表6 RSG对RHR组大鼠各指标的影响（略） 3 讨 论
本实验参照Reaven［4］的方法加以改进，成功地复制了胰岛素抵抗高血压大鼠模型。同时制作了两肾一夹肾血管性高血压大鼠模型。结果显示IRHR除了血压升高外，还出现了HIS及高LP血症，而RHR血压升高的同时并没有出现HIS及高LP血症。
胰岛素除了参与三大物质（糖、脂、蛋白质）代谢外，还有其他一些生理功能，如促进肾脏重吸收水、钠，增加交感神经系统（sympathetic nervous system，SNS）的兴奋性，影响某些膜离子如Ca2+/Mg2+的代谢，促进小动脉平滑肌增生等［7］。在INS代谢正常、胰岛β细胞功能尚未损害的IR初期，虽然糖代谢出现IR并产生代偿性HIS，但是糖代谢以外的INS的生理作用，如促进肾小管重吸收钠和增加SNS活性的作用尚未发生抵抗，HIS可通过潴钠及使血儿茶酚胺水平升高等作用而促使血压升高［7］。本实验从IRHR组与C组各指标对比可以看出，IRHR的SBP升高的同时，FINS升高，而ISI则降低，提示该组大鼠出现了IR和HIS。相关分析中该组SBP与FINS正相关，与ISI负相关，提示IR/HIS在高血压的形成中起了重要作用。LP是ob 基因（obese gene，即LP基因）编码、脂肪细胞分泌的一种脂源性内分泌多肽激素，其生理作用主要是抑制食欲，增加能量消耗等［8］。由于LP受体的广泛分布，LP还具有其他多种生物学效应，其中包括升高血压作用。从IRHR组与C组各指标对比可以看出，IRHR的SBP的升高的同时，LP也升高，且相关分析中LP与SBP呈正相关，提示LP参与了高血压的进程。LP导致血压升高的可能的机制为：提高SNS兴奋性［9］；通过RAS增加心脏后负荷［10］；降低一氧化氮水平和增加肾小管对钠的重吸收而对血压产生影响［11-12］等。而IRHR模型中相关分析显示LP与FINS正相关，提示二者之间关系密切。大量研究发现：INS与LP在体内借助脂肪细胞-胰岛轴及脂肪细胞-下丘脑轴进行相互调节［8］。当大鼠出现IR和代偿性HIS后，刺激LP分泌增多，而高LP血症导致的LP抵抗又使LP抑制INS分泌能力下降，使INS水平进一步升高，形成恶性循环，最终可共同促使血压升高。
用RSG干预后IRHR血压明显降低，同时FINS及LP明显的下降，而ISI有明显上升，显示出RSG明显改善了IRHR的IR/HIS及高LP血症，并且有明显的降血压作用。RSG属于TZDs胰岛素增敏剂，作用靶点是过氧化物酶体增殖因子活化受体γ（PPAR-γ）。RSG通过高选择性地激动PPAR-γ调节一大类参与葡萄糖生成、转运、利用以及与脂肪酸代谢胰岛素反应性基因的转录［13］，并增加外周组织葡萄糖转运子对葡萄糖的摄取和转运，从而可提高INS的敏感性，改善IR和HIS［14］。此外，研究显示RSG不仅可通过促进脂肪代谢限速酶的合成显著抑制LP水平［15］，而且还可经LP与FINS之间的双向反馈环［8］，通过增加INS的敏感性，降低INS水平来减少LP的分泌。推测RSG正是通过改善IR/HIS及高LP血症发挥降血压作用。与IRHR模型相比，RHR模型血压升高机制中没有IR/HIS以及高LP血症参与，而RSG亦未在此组大鼠中起降压作用，从另一个侧面证实了RSG的降压途径。有报道说RSG尚可通过直接扩张血管起降压作用［16-17］，本实验证实RSG在此方面的降压作用微弱。
【
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