作者：陈昊 白玲 张昶 刘毅 孟健
【摘要】 目的 探讨白细胞介素18（IL-18）、血管内皮生长因子-C（VEGF-C）及其受体3（VEGFR-3）在大肠癌中的表达意义及与淋巴结转移的关系。方法 应用免疫组化MaxVision快捷二步法检测30例大肠癌组织中IL-18、VEGF-C、VEGFR-3表达情况，并以10例正常黏膜和10例淋巴结转移性大肠癌组织标本做对照。结果 IL-18、VEGF-C、VEGFR-3在大肠癌组织中的表达均明显高于正常黏膜（P＜0.05）；IL-18 及VEGF-C在淋巴结转移性大肠癌组织中的表达也高于正常黏膜，且IL-18与VEGF-C的表达呈正相关（P＜0.05）；VEGF-C在淋巴结有转移组的表达明显高于淋巴结无转移组（P＜0.05）。结论 大肠癌细胞可表达IL-18、VEGF-C、VEGFR-3，其表达与大肠癌的发生、发展有关；VEGF-C表达与大肠癌淋巴结转移显著相关，可作为判断患者淋巴结转移的重要指标。
【关键词】 大肠癌；血管内皮生长因子-C；血管内皮生长因子受体3；白细胞介素18；淋巴结转移性大肠癌
Abstract： Objective To investigate the expressions of IL-18， VEGF-C and VEGFR-3 in human colorectal cancer and their significance in lymphatic metastasis. Methods Immunohistochemical MaxVision method was used to detect the expression of IL-18， VEGF-C and VEGFR-3 in 30 specimens of colorectal cancinoma， 10 normal mucosa and 10 lymph node with metastatic cancer. Results The expressions of IL-18， VEGF-C and VEGFR-3 in colorectal carcinoma were significantly higher than that in normal mucosa (P&<0.05). IL-18 and VEGF-C were higher in metastatic lymph nodes than in normal mucosa， with the two expressions positively correlated (P＜0.05). The expression of VEGF-C was higher in the lymph node with metastatic cancer than in that without (P＜0.05). Conclusion Colorectal carcinoma cells can express IL-18， VEGF-C and its receptor VEGFR-3， their higher expressions are correlated with the carcinogenesis and development of colorectal carcinoma. The higher expression of VEGF-C is closely correlated with lymphatic involvement， and thus could be used as an important predictive marker for lymphatic metastasis.
Key words: colorectal neoplasm; interleukin 18; vascular endothelial growth factor-C; vascular endothelial growth factor receptor 3; lymph node; metastasis
淋巴道转移是大肠癌进展的重要因素。淋巴管生成（lymphangiogenesis）作为淋巴道转移的分子机制，近年来越来越受到重视。新近研究表明，血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C， VEGF-C）可通过VEGF-C/VEGFR-3(vascular endothelial growth factor receptor-3)信号通路［1］介导淋巴管内皮细胞增殖，调节淋巴管内皮细胞分化和淋巴管增生促进肿瘤淋巴道转移，被称为淋巴管生成因子；白细胞介素18(interleukin-18， IL-18)是新近发现主要由巨噬细胞和树突状细胞分泌的细胞因子，可通过不同的信号转导途径起效，具有抗感染、抗肿瘤、介导炎症反应、诱导靶细胞凋亡等多种生物学活性［2］。IL-18对淋巴管生成的作用，尚未见报道。我们采用免疫组化MaxVision快捷二步法检测大肠癌组织中IL-18、VEGF-C（VEGFAb-3）和VEGFR-3 (fms-like tyrosine kinase -4， Flt-4)的表达变化规律，并以正常大肠黏膜和淋巴结转移大肠癌组织对照，探讨其表达意义及与淋巴道转移之间的关系，旨在为大肠癌的分子靶向治疗提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1．1．1 研究对象 选取我院外科2003年—2007年间手术切除大肠癌组织标本30例，术前未经过任何放射或化学治疗。患者年龄30~81岁，平均（59.23±14.77）岁，男23例、女7例。另选正常大肠黏膜10例和10例转移性大肠癌淋巴结组织为对照。
1．1．2 试剂 兔抗人IL-18浓缩型抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，VEGFAb-3及Flt-4为LabVision-NeoMarkers公司产品，即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.2 方法
1．2．1 免疫组化MaxVision检测方法 5 μm石蜡切片脱蜡和水化后；用PBS（pH 7.4）冲洗3次；高压锅热修复；每张切片加3%的过氧化氢1滴，室温孵育10 min；用PBS冲洗3次；每张切片分别加1滴抗体稀释度为1∶100的IL-18、VEGFAb-3或Flt-4；4℃过夜；用PBS冲洗3次；每张切片加1滴即用型MaxVision试剂，室温孵育10~15 min；用PBS（pH 7.4）冲洗3次；每张切片加2滴新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察控制显色时间；终止显色后，自来水冲洗，苏木精复染；自来水冲洗返蓝，经梯度乙醇脱水干燥；二甲苯透明，中性树胶封固。PBS代替一抗做阴性对照。
1．2．2 结果判定标准 显微镜下观察细胞，在胞质出现定位明确、染色明显的棕黄色颗粒为阳性细胞。按阳性细胞比例，组织蛋白表达强度分为以下几级：无细胞着色为（-）；阳性细胞数＜25%为（+）；阳性细胞数在25%~50%为（++）；阳性细胞数＞50%为（+++）。组织染色（++）~（+++）者定为高表达组，（+）者定为低表达组，（-）为阴性。
1．3 统计学处理 使用SPSS 10.0软件统计分析，计数资料的比较采用χ2检验之Fisher确切概率法；相关性用Pearson相关分析；P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2．1 IL-18、VEGF-C、VEGFR3的表达情况
2．1．1 IL-18表达情况 IL-18阳性颗粒主要定位于细胞质（图1），正常大肠黏膜组织的阳性表达率为40%（4/10），4例均为低表达，占100%；大肠癌组织中的阳性表达率为96.67%（29/30），低表达占30%，高表达占70%；淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性率为100%（10/10），低表达占40%，高表达占60%。IL-18在大肠癌组织及淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性表达率差异无统计学意义（χ2=0.333， P=1.000），并以高表达为主；但均高于正常黏膜，且有统计学意义（χ2=16.264， P=0.000; χ2=8.143， P=0.011）。
图1 IL-18在大肠癌组织的阳性表达
（免疫组化，×200）
2．1．2 VEGF-C表达情况 VEGF-C阳性颗粒主要定位于细胞质（图2）。正常大肠黏膜组织的阳性表达率为30%（3/10），3例均为低表达，占100%；大肠癌组织中的阳性表达率为80%（24/30），低表达组占40%，高表达占60%；淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性率为100%（10/10），均为低表达。VEGF-C在大肠癌组织及淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性表达率差异无统计学意义（χ2=2.294， P=0.307），在大肠癌组以高表达为主，在后者全部低表达；但两者均高于正常黏膜，且有统计学意义（χ2=8.333， P=0.006；χ2=10.231， P=0.003）。
2．1．3 VEGFR-3的表达情况 VEGFR-3阳性颗粒定位于细胞质（图3）。正常大肠黏膜组织的阳性表达率为30%（3/10），3例均为低表达，占100%；大肠癌组织中的阳性表达率为96.67%（29/30），低表达占10%，高表达占90%；淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性率为60%（6/10），低表达占100%。VEGFR-3在大肠癌组织中的阳性表达率高于淋巴结转移性大肠癌组织和正常黏膜，且有统计学意义（χ2=8.989， P=0.010；χ2=20.312，P=0.000）；淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性表达率与正常黏膜差异无统计学意义（χ2=1.727，P=0.370）。
图2 VEGF-C在大肠癌组织的阳性表达
（免疫组化，×200）
图3 VEGFR-3在大肠癌组织的阳性表达
（免疫组化，×200）
2．2 IL-18、VEGF-C及VEGFR3在大肠癌组织表达与临床病理特征的关系 鉴于在大肠正常黏膜组织中观察到三者均有（+）的低表达，将与临床病理特征的关系用高表达组和低表达组进行统计分析，详见表1。三者表达强度与性别、年龄、组织分化、组织类型、组织分期均无关（P＞0.05）。IL-18、VEGFR3在淋巴结转移组的表达强度虽高于无转移组，但无统计学意义（P＞0.05）。VEGF-C在淋巴结转移组的表达明显高于淋巴结无转移组，且有统计学意义（χ2=5.438，P=0.024）。
3 讨 论
肿瘤转移通常是人类癌症致死的主要原因，在肿瘤转移过程中血管内皮生长因子及其受体家族发挥了重要的作用。目前认为，VEGF家族可通过VEGF/VEGFR-1途径诱导血管生成，VEGF-C/D与VEGFR-2结合可诱导血管的生成，而通过VEGFR-3与VEGF-C/D结合途径诱导淋巴管生成［3］。虽然VEGF-C/D在诱导淋巴管或血管生成中的选择性作用机制还不是十分明确，但阻断VEGFR-3信号通路可能是抑制肿瘤淋巴道转移的途径之一。
本实验结果显示大肠癌组织中VEGFR-3的阳性率高于正常黏膜和淋巴结转移性大肠癌组织（P＜ 0.05），且处于高表达状态；而VEGF-C在大肠癌组织和淋巴结转移性大肠癌组织中的阳性表达率明显高于正常黏膜（P＜0.05）；VEGFR-3在淋巴结有转移组的表达强度虽高于无转移组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。VEGF-C在淋巴结有转移组的表达明显高于淋巴结无转移组，且有统计学意义（P＜0.05）。表明VEGFR-3和VEGF-C均参与了大肠癌的发生、发展，VEGF-C在淋巴结转移中发挥了重要作用。提示阻断VEGF-C/VEGFR-3信号通路，可减缓大肠癌的发展；VEGF-C可作为大肠癌淋巴道转移的预测因子。
众所周知，机体的免疫状态是导致肿瘤发生、发展的重要原因之一。IL-18是新近发现的γ-干扰素诱导因子，可通过不同的信号转导途径起效，并能抑制肿瘤血管的形成，从而发挥抗肿瘤的作用［4］。另有研究报道，IL-18在肿瘤免疫中有可能与IL-2发挥协同作用，诱导NK细胞和T细胞产生IL-13，促使Th3分化，从而影响机体细胞免疫状态，导致肿瘤的扩散和转移［5］，在胃癌［6］、结肠癌［7］患者术前血清中IL-18水平明显高于正常对照组。本实验结果显示，大肠癌组织和淋巴结转移性大肠癌组织中IL-18阳性表达率明显高于正常黏膜（P＜0.05），癌组织中有70%的高表达，但与临床病理特征无关，与VEGF-C的表达呈明显正相关（P＜0.05）；表明大肠癌时细胞中IL-18的表达升高，影响机体细胞免疫功能状态，参与大肠癌淋巴道转移，导致肿瘤进展。
本实验中3种蛋白均可观察到细胞核中有表达的现象，经与试剂公司沟通交流后，排除缓冲液pH值的影响，考虑可能为抗体稀释度较高的原因所致。
【
参考文献
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