【摘要】 目的 研究抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetylcysteine， NAC)对胃缺血/灌注(gastric ischemia/reperfusion， GI/R)损伤的影响。方法 采用股静脉注射NAC后，夹闭大鼠腹腔动脉30 min，再灌注1 h的GI/R模型，计数胃黏膜损伤指数(gastric mucosal damage index， GMDI)，测定胃黏膜组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性，RT-PCR法检测凋亡相关因子环氧合酶-2(COX-2)的表达。结果 股静脉注射NAC能降低GI/R胃黏膜损伤指数，使胃黏膜组织中 MDA含量减少，SOD活性增强，凋亡相关因子COX-2的表达减少。结论 NAC对大鼠GI/R损伤具有保护作用，这种保护作用是通过抑制氧化应激，减少胃黏膜细胞凋亡而实现的。
【关键词】 N-乙酰-L-半胱氨 胃缺血/再灌注 胃黏膜损伤指数 超氧化物歧化酶
Abstract：Objective To study the effect of antioxidant N-acetylcysteine (NAC) on gastric ischemia/reperfusion (GI/R) in rats．Methods After injection of NAC into femoral vein， the GI/R model was established by clamping the celiac artery for 30 min to induced ischemia and allowing reperfusion for 1 h. The rats were finally sacrificed to investigate gastric mucosal damage index (GMDI)， determine the content of malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) in gastric mucosa. The expression of apoptosis -related COX-2 was detected by RT-PCR.Results Injection of NAC into femoral vein could decrease gastric mucosal damage index， reduce the content of MDA， raise the activity of SOD and inhibit the expression of COX-2 in gastric mucosa following GI/R.Conclusion NAC can protect against GI/R injury by inhibiting oxidative stress and reducing cell apoptosis in gastric mucosa.
Key words： N-acetylcysteine; gastric ischemia/reperfusion； gastric mucosal damage index； superoxide dismutase
器官缺血/再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)时，由于机体氧化系统和抗氧化系统失衡，氧自由基( reactive oxygen species， ROS)产生增多，在体内蓄积过多，使器官组织的细胞膜脂质过氧化，从而造成损伤［1］。采用抗氧化剂防治器官I/R损伤已经受到了人们的重视。N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)是一种抗氧化剂，作为谷胱甘肽(glutathione， GSH)的前体物质，可以减轻I/R造成的机体损伤［2］。但是NAC对GI/R损伤的影响及其可能的机制，目前尚未见报道。因此，本实验主要采用股静脉给予NAC后，观察对大鼠胃缺血/再灌注（gastric ischemia/reperfusion， GI/R）损伤的影响，测定胃黏膜组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性变化及凋亡相关因子环氧合酶-2(COX-2)的表达，并对其机制进行了初步的探讨。
1 材料和方法
1.1 实验药物和试剂 NAC购自Sigma公司，SOD和MDA试剂盒购自南京建成生物研究所，cDNA链合成试剂盒和PCR扩增试剂盒购自上海天根生物有限公司，PCR引物购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.2 实验动物和分组 成年雄性健康SD大鼠，体重250～300 g，由徐州医学院实验动物中心提供。实验前禁食24 h，自由饮水。实验动物随机分为假手术组（sham组）、胃缺血/再灌注组（GI/R组）、NAC+GI/R组（NAC组），每组6只。
1.3 GI/R模型和样本制备 实验时动物以10%的水合氯醛(300 mg/kg， ip）麻醉，在股静脉给予NAC（150 mg/kg）后，按我实验室方法［3］，开腹，分离并夹闭腹腔动脉30 min，去除动脉夹恢复血流。于再灌注后1 h 处死动物，快速取胃，沿胃大弯剪开，1%冷PBS液冲洗干净，置于冰上展开，计数胃黏膜损伤指数（GMDI）后，留取胃黏膜标本：剪取一侧胃黏膜于5 ml EP管中，低温匀浆分别制成10%和1%的组织匀浆液，置于-20℃冰箱待测SOD、MDA；剪取另一侧胃黏膜于5 ml无核酶EP管中，置于-80℃冰箱待测COX-2。
1.4 胃黏膜损伤指数的测定 按我实验室方法［4］:以胃腺区局限于胃上皮的点状糜烂、溃疡、出血灶的长度累积计分：正常为0分，损伤&<1 mm计1分，&>1 mm 并且≤2 mm计2分，&>2 mm并且≤3 mm计3分，余类推。损伤宽度超过1 mm时分数加倍。每组大鼠损伤分数的平均值为损伤指数。
1.5 MDA含量和SOD活性的测定 分别采用硫代巴比妥(TAB)法和黄嘌呤氧化酶法，按照试剂盒中说明书的步骤操作。
1.6 凋亡相关因子COX-2表达测定 采用RT-PCR法，严格按试剂盒中说明书的步骤提取胃黏膜组织中的RNA和配置反应体系。COX-2(254 bp)：上游引物5′-GCTTCGGGAGCAC-AACAGAG- 3′，下游引物5′-TCAGCGGATGCCAGTGATAGA-3′。β-actin(217 bp)：上游引物5′-TGTCCCTGTATGCCTCTGGT-3′，下游引物5′-TTGATGTCACGCACGATTTC-3′。COX-2和β-actin的反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，30个循环，72℃ 5 min终末延伸，4℃终止反应。取扩增的cDNA产物9 μl于1%琼脂糖凝胶中电泳，经凝胶成像系统分析成像，各组COX-2片段与β-actin片段的平均光密度（D）比值作为COX-2 mRNA的相对量，并进行比较。
1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，实验数据以±s表示，组间比较采用t检验，P&<0.05有统计学意义。
2 结 果
2.1 NAC对大鼠GI/R胃黏膜损伤、胃黏膜组织中MDA含量及SOD活性的影响 GI/R组GMDI明显高于sham组（P&<0.01），NAC组GMDI高于sham组（P&<0.05）；NAC组GMDI低于GI/R组（P&<0.05 ）。GI/R组MDA含量明显高于sham组（P&<0.01），NAC组MDA高于sham组（P&<0.05 ）；NAC组MDA含量低于GI/R组（P&<0.05）。GI/R组SOD活性明显低于sham组（P&<0.01），NAC组SOD活性低于sham组（P&<0.05 ）；NAC组SOD活性高于GI/R组（P&<0.05）。见表1。
2.2 NAC对GI/R大鼠胃黏膜组织中COX-2表达的影响 RT-PCR结果显示：GI/R组COX-2的表达明显高于sham组（P&<0.01），NAC组COX-2的表达高于sham组（P&<0.05），NAC组COX-2的表达低于GI/R组（P&<0.05）（表2，图1）。表1 NAC对GI/R胃黏膜损伤、胃黏膜组织中MDA含量及SOD活性的影响表2 NAC对GI/R大鼠胃黏膜组织中COX-2表达的影响
3 讨 论
器官I/R损伤是由于再灌注恢复血流时，ROS生成增多，机体抗氧化能力减弱，进而损伤线粒体，使脂质代谢障碍，并且激活与凋亡相关的信号通路，使I/R组织细胞凋亡增多从而导致组织器官的损伤［5-6］。因此，治疗器官I/R损伤应从抗氧化方面着手，提高机体的抗氧化能力，减少ROS生成，抑制凋亡信号通路的激活是防治I/R损伤的关键。有研究报道， NAC作为一种抗氧化剂可以对抗氧自由基对I/R组织的损伤，此外，NAC还可以抑制多种凋亡相关信号通路的激活，减少细胞凋亡。在心肌再灌注损伤中，NAC可以减少再灌注时ROS的生成，促进ROS清除，同时，NAC还可抑制氧化应激时多种凋亡相关因子和凋亡信号通路的激活，减少心肌I/R时细胞的凋亡［7-11］。NAC可以增加脑I/R时组织细胞的抗氧化性，减少ROS的生成。同时，抑制凋亡信号通路的激活，减少氧化应激时脑细胞的凋亡［12］。
综上所述，NAC可以增加I/R损伤时组织细胞的抗氧化性，减少氧化应激早期ROS生成，促进ROS清除，减轻组织损伤。此外，NAC可以抑制氧化应激时凋亡相关信号通路的激活，抑制细胞凋亡，减轻组织细胞的损伤。然而NAC是否可以减轻大鼠GI/R损伤？及其相关机制如何？这是我们感兴趣的问题。
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