【摘要】 目的 构建海人藻酸受体亚基GluR6的shRNA真核细胞表达载体，进一步研究GluR6在脑缺血中的作用机制。方法 根据GenBank数据库中GluR6的cDNA序列设计靶序列，化学合成两条互补的DNA寡核苷酸链，连接质粒后转染大肠杆菌，使其在大肠杆菌内大量复制；提取质粒，进行限制性内切酶酶切鉴定及测序分析。结果 限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了序列的正确性，与合成的寡核苷酸序列完全相符，且以正确的方向插入。结论 成功构建了GluR6特异性shRNA真核表达载体。
【关键词】 GluR6 载体
Abstract:Objective To construct the eukaryotic expression plasmid for kainate receptor (KA) subunit GluR6 specific shRNA.Methods According to the GluR6 cDNA sequence， two strands of oligonucleotide were designed and chemically synthesized， and then annealed into two double strands in vitro. The DNA strands were ligated with plasmid vector pSilencer-GluR6. The recombinate plasmid was transfected into E. coli and multiplied. After being extracted from E. coli， the plasmids were processed to verify the sequence of the shRNA by restriction endonuclease digestion and sequencing.Results The recombinant plasmid was found containing correct and complete sequence of the shRNA， indicating that the specific GluR6 shRNA had been inserted into the eukaryotic expression plasmid.Conclusion The eukaryotic expression plasmid pSilencer-GluR6 has been successfully constructed.
Key words: GluR6; shRNA; vector
谷氨酸（Glu）是中枢神经系统(CNS) 中重要的神经递质，它广泛分布于 CNS，在 CNS 的突触传递过程中发挥着重要作用。另外，Glu能神经传递的异常往往与一些神经疾病发生有关，如癫疒间、缺血、阿尔茨海默病等［1-2］。Glu受体分为代谢型Glu受体(mGluR)和离子型Glu受体(iGluR)。 iGluR是非特异性阳离子通道，根据它们所首选的配体的不同可分为 NMDA 受体和非NMDA受体两类，非NMDA受体又可分为AMPA受体和KA受体［3-4］。由于缺乏选择性药物，KA受体在脑内的生理功能长期未被阐明。近年来随着非NMDA受体的药理学研究取得重要突破以及基因敲除技术的应用，人们对KA受体在脑内的生理功能有了初步的认识。KA受体亚基包括GluR5、GluR6、GluR7、KA1和KA2，只有GluR5、GluR6、GluR7可以形成功能性的离子通道，KA1和KA2起调节亚基的作用［5-6］。我们前期的研究发现，GluR6的特异性拮抗剂NS102以及GluR6反义寡核苷酸均有神经保护作用［7-8］。本研究构建GluR6特异性shRNA真核表达载体pSilencer3.1-GluR6，为进一步研究GluR6在脑缺血中的作用机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 质粒、菌株 质粒pSilencer3.1购自Ambion公司，大肠杆菌JM101为本实验室保存。
1.2 主要试剂 质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ为Promega公司产品，1 kb DNA Marker购自Invitrogen公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 寡核苷酸序列 针对GluR6的cDNA序列设计合成2条序列。序列如下：正义链，5′-GATCCGCAATCCTTGGCTTTACATATTCAAGAGATATGTAAA
GCCAAGGATTGTTTTTTGGAAA-3′；反义链，5′-AGCTTTTCCAAAAAACAATCCTTGGCTTTACATATC
TCTTGAATATGTAAAGCCAAGGATTGCG-3′。用无核酶的水将每条寡核苷酸稀释成1 g/L。构建退火反应体系：正义寡核苷酸模板链2 μl加反义寡核苷酸模板链2 μl再加无核酶的水46 μl，将混合物加热到90℃作用3 min，然后冷却至37℃孵育1 h，退火后的产物置-20℃保存备用。
1.4 pSilencer3.1-GluR6的构建及鉴定 用45 μl无核酶的水将5 μl退火后的siRNA模板稀释到8 mg/L。构建连接反应体系10 μl：稀释的退火后的siRNA模板1 μl、无核酶水6 μl、10×T4 DNA连接酶缓冲液1 μl、T4 DNA连接酶1 μl、pSilencer 1 μl，22℃水浴3 h。将10 μl连接产物加入100 μl预先制备的JM101感受态细胞中混匀，冰浴30 min，立即放入37℃水浴5 min，加入220 μl预热的LB培养基37℃水浴1 h。取200 μl均匀涂布于LB琼脂平板上(含氨苄青霉素8 g/L)，37℃培养过夜。在氨苄青霉素筛选平板上挑取单克隆菌落于5 ml LB培养基中培养过夜。扩增、提取、纯化质粒，分别以BamH Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切鉴定重组子，对筛选出的阳性克隆进行序列分析。
2 结 果
2.1 pSilencer3.1-GluR6的双酶切鉴定 琼脂糖凝胶电泳显示：双酶切后有2条DNA条带，其大小分别与载体pSilencer3.1(4285 bp)和GluR6的siRNA模板(64 bp)相一致(图1)。
图1 pSilencer3.1-GluR6双酶切产物电泳图
M．1 kb DNA Marker G．pSilencer3.1-GluR6 BamH Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切产物
2.2 pSilencer3.1-GluR6的序列分析鉴定 测序结果显示， pSilencer3.1-GluR6中shRNA序列与预期序列相一致(图2)。结果表明，GluR6的shRNA已成功克隆至pSilencer3.1真核表达载体。
3 讨 论
最近有研究发现，KA受体亚基GluR6缺陷的小鼠对KA不敏感并拮抗KA诱导的神经毒［9］；同样，JNK3缺陷的小鼠对KA诱导的海马神经元的凋亡有拮抗作用［10］。因此，这两项研究提示在整体动物模型中，JNK的激活可能涉及GluR6介导的兴奋毒性。
【参考文献】
［1］ Gardoni F， Di Luca M. New targets for pharmacological intervention in the glutamatergic synapse ［J］. Eur J Pharmacol， 2006， 545(1): 2-10.
［2］ Bittigau P， Ikonomidou C. Glutamate in neurologic diseases ［J］. J Child Neurol， 1997， 12(8): 471-485.
［3］ Seeburg PH. The TINS/TiPS Lecture. The molecular biology of mammalian glutamate receptor channels ［J］. Trends Neurosci，1993，16(9)：359-365.
［4］ Hollmann M， Heinemann S. Cloned glutamate receptors ［J］. Annu Rev Neurosci， 1994，17:31-108.
［5］ Pinheiro P， Mulle C. Kainate receptors ［J］. Cell Tissue Res， 2006， 326(2):457-482.
［6］ Lerma J， Paternain AV， Rodríguez-Moreno A， et al. Molecular physiology of kainate receptors ［J］. Physiol Rev， 2001， 81(3):971-998.
［7］ Tian H， Zhang QG， Zhu GX， et al. Activation of c-Jun Nh3-terminal kinase 3 is mediated by the GluR6·PSD - 95·MLK3 signaling module following cerebral ischemia in rat hippocampus ［J］. Brain Res， 2005， 1061(1):57-66.
［8］ Pei DS， Guan QH， Sun YF， et al. Neuroprotective effects of GluR6 antisense oligodeoxynucleotides on transient brain ischemia/reperfusion-induced neuronal death in rat hippocampal CA1 region ［J］. J Neurosci Res， 2005， 82(5):642-649.
［9］ Mulle C， Sailer A， Pérez-Otao I， et al. Altered synaptic physiology and reduced susceptibility to kainate-induced seizures in GluR6-deficient mice ［J］. Nature， 1998，392(6673):601-605.
［10］ Yang DD， Kuan CY， Whitmarsh AJ， et al. Absence of excitotoxicity-induced apoptosis in the hippocampus of mice lacking the Jnk3 gene ［J］. Nature，1997， 389(6653)：865-870.