参麦注射液对大鼠神经元内质网应激诱导凋亡的影响

　　　　 作者：李晓峰 张红 董艳玲 王铁建 李燕华 李吕力

【摘要】 目的 探讨参麦注射液对大鼠皮层神经元内质网应激诱导凋亡的保护作用。方法 体外培养SD乳鼠皮层神经元细胞，免疫组织化学、免疫荧光染色鉴定神经元纯度，流式细胞术AnnexinＶ、PI双标检测凋亡率及活性caspase3、9表达，Western印迹免疫分析GRP78、细胞色素C蛋白、Bcl2蛋白表达，Fura2/AM法荧光分光光度计检测细胞内钙浓度（〔Ca2+〕i）。结果 SD乳鼠皮层神经元可纯化体外培养，2 μmol/L毒胡萝卜素作用神经元24、48 h细胞凋亡率分别是17.88%、21.38%，参麦治疗组分别是7.42%、8.16%，两组差异显著(P<0.05)。胡萝卜素诱导神经元糖调节蛋白GRP78表达上调，活化caspase3、9，使细胞色素C蛋白表达增加，Bcl2表达减少。参麦注射液促进细胞Bcl2表达，抑制细胞色素C释放，减少活性caspase3、9含量，降低〔Ca2+〕i浓度。结论 参麦注射液能抑制体外培养神经元内质网应激所致的凋亡可能与其降低〔Ca2+〕i浓度有关。

【关键词】 细胞凋亡；内质网应激；caspase；Bcl2；参麦注射液

　　【Abstract】 Objective To observe the protect effects of Shenmai (SM) injection on endoplasmic reticulum stressinducing rat cortical neuronal apoptosis. Methods Primary cortial neurons were cultured in vitro and NSEpositive cells were detected by immunofluorescence staining and immunohistochemistry. The percentage of apoptotic cells and protein expression of caspase3，9 were determined by flow cytometric analysis. Protein levels of GRP78， cytochrome C， Bcl2 were assessed by immunoblotting. Intracellular free calcium concertration 〔Ca2+〕i was measured with fluorophotometry. Results Cortical neurons of neonate rats could be cultured in vitro， the percentage of apoptosis induced by thapsigargin after intervened for 24 and 48 h was 17.88% and 21.38% respectively. GRP78 and cytochrome C protein levels were elevated in cortical neurons in response to thapsigargin. The expression of caspase3 and 9 were activated and the protein level of Bcl2 was decreased. SM significantly decreased the percentage of neuronal apoptosis and increased the expression of Bcl2， reduced neuronal 〔Ca2+〕i and the expression of caspase3 and 9， inhibited the leakage of cytochrome C.Conclusions SM has effect of antineuronal apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress in vitro， which might be related to decreasing intracellular free calcium concentration.

　　【Key words】 Apoptosis；Endoplasmic reticulum stress；Caspase；Bcl2；Shenmai injection

　　凋亡是脑缺血后神经元死亡的一种重要形式。凋亡信号途径包括外源性、内源性/应激途径。缺血后神经元的凋亡发生是一个多环节调控过程，其中包括基因表达的改变、兴奋性氨基酸的释放、钙离子稳态失衡、热休克蛋白表达受阻、脂肪酸与自由基形成、蛋白酶激活等过程，但脑缺血后神经元凋亡发生的确切机制目前还不十分清楚。内质网可能是细胞内诱导凋亡的一个新场所，内质网在应激状态下，可迅速诱导凋亡。毒胡萝卜素(thapsigargin)为不可逆性内质网钙ATP酶抑制剂，可诱导内质网应激。本研究旨在探讨大鼠皮层神经元内质网应激诱导细胞凋亡机制以及参麦注射液的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物与试剂

　　新生SD大鼠（出生24 h内）由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（鄂）20040007。高糖DMEM、神经元基础培养液、B27、胎牛血清、马血清购自GibcoBRL公司；胰蛋白酶、L多聚赖氨酸购自Sigma公司；Annexin VFTTC购自Bender MedSystems公司；Fura2/AM购自晶美生物公司；活性caspase3、caspase9试剂盒购自BioVision公司；AntiGRP78多克隆抗体购自Stressgen公司；Bcl2、细胞色素C试剂盒购自Santa Cruz公司；神经元特异性烯醇化酶(NSE)组化试剂盒购自北京中山公司；其他均为市售分析纯。参麦注射液由人参、麦冬组成，每支10 ml，含生药0.5 g，批号为0807046，正大青春宝药业有限公司出产。

　　1.2 仪器

　　CO2恒温细胞培养箱(Napco 5410220，美国)；荧光倒置显微镜(Olympus日本)；全自动酶标分析仪 （Thermo electron corporation Multiskan MK3，美国）；流式细胞仪(FACSCLSR，BectonDickton，美国)；F2000型双波长荧光分光光度计(Hitachi 850，日本)。

　　1.3 分组与给药

　　实验分为阴性对照组 (正常培养神经元)，毒胡萝卜素组(神经元基础培养液中加2%B27，加2 μmol/L毒胡萝卜素24～48 h)，参麦治疗组(神经元基础培养液中加2% B27，2 μmol/L毒胡萝卜素，参麦注射液10 ml/L 24～48 h)。

　　1.4 皮层神经元培养

　　取出生24 h以内SD大鼠皮层于冷解剖液(4℃)中，剥离脑膜、血管，将脑组织剪成≤1 mm3的组织块，入0.1%胰酶液，37℃水浴消化20 min，加种植培养液 (DEME中添加10%胎牛血清，10%马血清，pH 7.2～7.4) 终止消化并吹打，细胞悬液经200目滤网过滤，获得单细胞悬液，1×106/皿的密度接种于预先包被多聚赖氨酸的35 cm培养皿。第2天换维持培养液(神经元基础培养液中加2% B27），培养3～5 d半量换液，7～10 d用于实验。

　　1.5 神经元的鉴定

　　免疫组织化学染色标记NSE(北京中格公司产品)和IgG免疫荧光染色(FITC标记的兔抗鼠IgG 1∶2 000稀释)鉴定神经元。

　　1.6 参麦注射液对原代神经元活力的影响

　　神经元活力测定采用MTT法。取前述原代神经元(细胞计数达1×106/ml)，按每孔100 μl 接种于96孔板，培养5 d后随机分组，设置空白对照组 (用来调零，只加培养基，不加细胞)、阴性对照组 (药物浓度为零，加细胞，加培养基)、治疗组 (加参麦注射液，加细胞，加培养基)，治疗组参麦注射液终浓度10 ml/L。分别继续培养1、2、3 d，每孔加入MTT 15 μl，37℃孵育4 h，镜下观察形成紫色针状结晶，小心弃去上清，每孔加入DMSO 100 μl，室温下放置10 min。待镜下观察紫色结晶全部溶解后，以Dynatech MR400 ELISA读数仪测定MTT吸光度值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。

　　1.7 流式细胞分析仪检测神经元凋亡及caspase3、9活性

　　取上述分组培养的神经元经胰蛋白酶消化后在4℃离心5 min，去上清后细胞沉淀用冷PBS洗2次，加195 μl结合缓冲液悬浮细胞，然后加入Annexin VFTTC 5 μl，室温避光孵育10 min，结合缓冲液洗3遍，190 μl结合缓冲液重悬细胞，加10 μl (20 μg/ml) PI (终浓度1 μg/ml)，上机检测，重复3次。取上述各组及阴性对照组细胞 (正常培养的细胞培养液中加1×106/ml caspase3、9抑制剂共孵育) 消化、重悬，取300 μl细胞悬液于EP管中，每管分别加入1 μl FITC标记的caspase3、9，37℃ 5% CO2恒温细胞培养箱孵育1 h，3 000 r/min离心5 min，弃上清，0.5 ml缓冲液重悬细胞，3 000 r/min离心5 min，弃上清，300 μl缓冲液重悬细胞，上机检测，重复3次。

　　1.8 GRP78、Bcl2、细胞色素C免疫印迹分析

　　各组细胞按照总蛋白提取试剂盒操作提取总蛋白，按蛋白定量试剂盒说明定量。免疫印迹操作参照Elyaman等〔1〕的方法进行。每组实验重复3次。利用激光扫描光密度分析法半定量测定细胞GRP78、Bcl2、细胞色素C水平变化。

　　1.9 荧光分光光度计测钙浓度

　　准备细胞数为106～109/L，细胞存活率90%以上。负载Fura2/AM：将细胞与2 ml负载液及10 μl Fura2/AM一起于37℃孵育30 min。无钙清洗液洗涤细胞后荧光测定。37℃恒温测定荧光强度，连续测定340、380 nm波长激发光交替激发时，510 nm发射新的荧光强度F，同时记录荧光强度比值R(R=F340/F380)。校正参数Rmax为饱和时产生的最大荧光比值，以10% TritonX100测得。Rmin为游离时的最小荧光比值，以5 mmol/L测得。自身荧光以未孵育Fura2/AM的细胞同法测量，计算〔Ca2+〕i时减去。细胞胞质游离钙浓度〔Ca2+〕i计算：〔Ca2+〕i=Kd(RRmin)/(RmaxR) Ff2/Fb2。其中平衡常数Kd在37℃时为224 nmol/L，R为340、380 nm荧光强度比值(F340/F380)。校正参数分别为游离时形成的最大、最小荧光比值，Ff2与Fb2分别为游离与饱和380 nm荧光强度。

　　1.10 统计学处理

　　数据以x±s表示。应用SPSS 12.0软件进行组间t检验。

　　2 结 果

　　2.1 原代神经元培养

　　2.1.1 正常神经元的形态观察

　　接种后2 h，部分细胞开始贴壁，贴壁细胞呈圆形；4 h后，贴壁细胞渐多，个别细胞开始伸出突起；24 h后，大部分细胞已贴壁，可见光滑的突起，胞体小，折光性较暗，周围有光晕；第3天，神经元胞体增大，突起延长并出现分支，形成稀疏的网络，神经元以多极神经元为主，胞体呈三角形、锥形或椭圆形，也有双极神经元；第5天，神经元胞体进一步增大，突起增粗、增长，末端分叉明显，已交织成网，胞体和突起晕光明显，立体感强；第7天，神经元生长旺盛，胞体大，突起长，分支连接成网，见图1。

　　2.1.2 原代神经元培养鉴定

　　取培养7 d的皮层神经元经NSE染色后，计数NSE阳性细胞数占细胞总数的百分数为(97.2±4.1)%(n=5)，故可认为是纯神经元培养，见图1。

　　2.2 参麦注射液对原代神经元活力的影响

　　MTT比色分析显示，10 ml/L参麦治疗组1～3 d神经元的OD值高于阴性对照组，与阴性对照组比较，参麦治疗组细胞活力显著高于阴性对照组(P<0.05)，见表1。表1 参麦注射液对神经元活力的影响（略)

　　2.3 参麦注射液对毒胡萝卜素诱导的神经元凋亡的影响

　　正常培养大鼠皮层神经元经2 μmol/L毒胡萝卜素诱导后，细胞凋亡明显增加，24 h凋亡率为17.88%，至48 h凋亡率为21.38%；参麦治疗组在2 μmol/L毒胡萝卜素诱导的同时加用参麦注射液，培养至24 h凋亡率为7.42%，至48 h凋亡率为8.16%。两组对比，参麦治疗组细胞凋亡率显著低于毒胡萝卜素组(P<0.01)。

　　2.4 参麦注射液对活性caspase3、9表达的影响

　　在原代培养的神经元经2 μmol/L毒胡萝卜素作用24、48 h，活性caspase3、9的表达明显，加用10 ml/L参麦注射液，两者表达均明显下降(P<0.05)，见表2。表2 参麦注射液治疗前后caspase3、9的表达（略)

　　2.5 GRP78、细胞色素C、Bcl2免疫印迹分析

　　2 μmol/L毒胡萝卜素24、48 h，神经元GRP78免疫活性明显增加，参麦治疗组GRP78活性减低，两组相比，GRP78免疫活性变化无统计学意义(P>0.05)。2 μmol/L毒胡萝卜素24、48 h，神经元细胞色素C表达增加，而参麦治疗组表达减低，两组比较细胞色素C表达治疗组显著低于毒胡萝卜素组(P<0.05)。神经元Bcl2免疫活性在2 μmol/L毒胡萝卜素作用24 h有较低表达，参麦治疗组Bcl2表达明显增强，显著高于毒胡萝卜素组(P<0.05)，见表3、图2。表3 GRP78、Bcl2、细胞色素C免疫印迹分析结果(略)

　　2.6 神经元〔Ca2+〕i浓度的测定

　　静息状态下原代培养神经元〔Ca2+〕i浓度为（74.4±0.6）nmol/L，原代培养的神经元经2 μmol/L毒胡萝卜素作用24、48 h，〔Ca2+〕i浓度为 (134.4±0.6)、(165.5±0.7) nmol/L。与静息状态对照组相比，毒胡萝卜素组神经元〔Ca2+〕i 明显高于阴性对照组(P<0.05)。参麦治疗24、48 h神经元〔Ca2+〕i浓度〔(112.5±1.7)、(117.6±1.9) nmol/L〕明显低于毒胡萝卜素组(均P<0.01)。

　　3 讨 论

　　多种细胞信号途径、应激状态可以引起细胞凋亡。触发细胞凋亡的分子机制包括：细胞外环境中必要的生存信号的丢失，兴奋性中毒，氧化应激，严重的DNA损伤，细胞器机能障碍，受体介导的死亡信号途径〔2〕。近年来，内质网作为线粒体凋亡途径的调节器越来越受到重视〔3〕。毒胡萝卜素可以诱导多种细胞发生内质网应激和细胞凋亡〔4〕，作为内质网应激标志物的分子伴侣GRP78在内质网发生应激时表达上调〔5〕。本实验提示神经元发生了内质网应激，而对照组只有很少表达；且caspase3、9均参与了毒胡萝卜素诱导的神经元凋亡机制。内质网也是细胞内Ca2+的重要储存场所，在细胞内Ca2+稳态、细胞功能维持以及细胞内信号传导等过程中发挥重要作用。内质网的Ca2+稳态改变和内质网非折叠或非正确折叠蛋白质的堆积均可引起内质网应激反应，如果内质网Ca2+稳态改变或/和非折叠蛋白质反应得不到纠正，将最终诱导细胞凋亡。

　　毒胡萝卜素作用位点是抑制内质网膜Ca2+ ATP酶，诱导胞浆内Ca2+浓度上升和内质网储存钙的下降，从而引起内质网应激，诱导凋亡。本实验发现，原代培养神经元在毒胡萝卜素作用下，胞浆〔Ca2+〕i浓度明显升高，并高于对照组。细胞凋亡是复杂的过程，线粒体途径、死亡受体途径、内质网等细胞器途径之间存在着复杂的交叉串话。Bcl2蛋白家族，包括Bcl2、Bax、BAD等，对凋亡起着重要的调节作用〔6〕。我们通过免疫印迹检测在内质网应激时，Bcl2免疫活性降低，细胞色素C表达增加。可能在细胞遭受应激反应时，内质网应激激活的相关caspase是凋亡的早期事件，随后导致线粒体外膜通透性增加，细胞色素C释放到胞浆，进而促进凋亡复合体的形成，激活效应caspase，引起凋亡。体外培养的大鼠皮层神经元凋亡机制中各途径之间的联系还有待进一步研究。

　　参麦注射液是化裁于古方生脉饮的中药注射制剂，主要生药成分是红参、麦冬，人参的有效成分是人参皂甙和人参多糖，具有清除氧自由基、抗脂质过氧化等作用，对缺血缺氧时代谢活动和微循环有保护作用，麦冬含有麦冬黄酮、维生素A、铜、锌等多种抗氧化物质，具有直接减少氧自由基产生或通过提高细胞内抗氧化酶活性抑制自由基、降低脂质过氧化作用〔7〕。研究表明〔8，9〕参麦注射液能显著减轻氧自由基对细胞的损伤，改善细胞能量代谢，降低脂质过氧化，提高超氧化物歧化酶（SOD）的活性，具有减轻脑细胞缺血损伤及抗细胞凋亡的作用。本实验发现，参麦注射液和毒胡萝卜素同时作用于皮层神经元，24、48 h细胞凋亡率明显减少，神经元胞浆Ca2浓度较实验组明显降低，同时实验组Bcl2免疫活性增强，细胞色素C表达较对照组减少。因此参麦注射液对体外培养大鼠皮层神经元有抑制凋亡的作用，且其抑制凋亡的作用是多个环节起作用的结果。

参考文献

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