抗衰老片对衰老大鼠学习记忆和自由基代谢的影响

　　　　作者：陶涛 潘永明 冷晓霞 寿旗扬 朱科燕 谢日青 杨玉伟 陈民利

【摘要】 观察抗衰老片对衰老大鼠学习记忆和脑自由基代谢的影响。［方法］取健康Wistar大鼠72只随机分为空白对照组、模型对照组、抗衰老片高、中、低剂量组、六味地黄丸组和首乌延寿片组。采用皮下注射D半乳糖100mg/kg，连续造模49天，建立大鼠衰老模型，各给药组在造模同时给予相应的药物，观察大鼠一般情况和体重变化，用水迷宫测试空间行为记忆能力，并测定脑组织自由基代谢SOD、MDA、GSHPx、Na+K+ATPase、Ca++Mg++ATPase、NO和TChE的变化。［结果］与空白对照组比，模型对照组体重增长率下降（P<0.01），脑组织中SOD、Na+K+ATPase、Ca++Mg++ATPase和GSHPx活力下降，MDA、NO和TChE均明显升高，水迷宫实验中探索路径和搜台潜伏期显著增加。给予不同剂量的抗衰老片、六味地黄丸和首乌延寿片后，能显著提高衰老大鼠体重的增长率，提高脑组织中SOD、Na+K+ATPase、Ca++Mg++ATPase和GSHPx活力，显著降低MDA、NO含量和TChE活性，缩短衰老大鼠在水迷宫实验的探索路径和搜台潜伏期。［结论］抗衰老片可改善衰老大鼠的学习记忆能力，增强记忆的功能，延缓自由基造成脑组织的脂质过氧化，抗衰老的作用机制可能与抑制体内脂质过氧化过程有关。

【关键词】 抗衰老片；学习记忆；自由基代谢；乙酰胆碱酯酶

　　　　 Fund project：1.special research subject of TCM“Treat Predisease”in Zhejiang Province（No：2007WB022）；2.Item supported by Training Project of Zhejiang Provincial Health HighLevel Creative Talents　本实验观察了抗衰老片对D半乳糖致衰老模型大鼠学习记忆和脑自由基代谢的变化，并以六味地黄丸和首乌延寿片为对照，探讨抗衰老片的药理作用及其机制。

1 材料与方法

　　1.1 试验药物

　　抗衰老片（浸膏粉），棕褐色粉末，批号：080320，由正大青春宝药业有限公司提供；六味地黄丸，批号：707360，北京同仁堂科技发展股份有限公司产品；首乌延寿片，批号：A060801，上海和黄药业有限公司产品。

　　1.2 实验动物及饲养环境

　　SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，体重：雌200～220g，雄240～260g，由中科院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物公司提供［SCXK（沪）2007-0005］，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障系统内［SYXK（浙）2003-0003］。

　　1.3 主要试剂　

　　 D半乳糖购自上海恒信化学试剂有限公司（原上海试剂二厂），批号：20071115；考马斯亮兰蛋白，丙二醛（MDA），超氧化物岐化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx），一氧化氮（NO），ATP酶，乙酰胆碱酯酶（TChE）测试试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，批号均为20070718。

　　1.4 主要仪器

　　BT815A半自动生化分析仪（上海三科仪器有限公司）；FJ200组织匀浆机（上海标本模型厂）；Morris水迷宫（西班牙Panlab 公司）。

　　1.5 造模与给药

　　将大鼠购入适应性饲养1周后，观察有无异常情况，然后将大鼠称重，编号，按体重随机分组，分成7组，每组12只，雌雄各半，自由进食饮水。除空白对照组外，其余各组每天颈背部皮下注射D半乳糖生理盐水溶液，剂量为100mg/kg，连续造模49天，每天一次。从造模第1天开始给药，抗衰老片高、中、低剂量组分别灌胃给予0.60g/kg、0.30g/kg、0.15g/kg剂量的抗衰老片浸膏粉，六味地黄丸组和首乌延寿片组分别灌胃给予六味地黄丸0.68g/kg和0.525g/kg，模型对照组和空白对照组每天灌胃给予蒸馏水10ml/kg，连续给药49天。

　　1.6 观察指标

　　1.6.1 一般观察

　　每日观察大鼠毛色、尾巴、粪便、活动情况，称取体重。

　　1.6.2 水迷宫空间行为记忆能力测试

　　采用Morris水迷宫测试。水迷宫主要由一漆成暗灰色的圆柱形水池和一金属站台组成。水池高50cm，直径80cm，站台直径10.0cm。水池上方通过一数字摄像机与计算机监视屏相连接。大鼠在水池中的全部活动情况可在监视屏中看到，利用计算机软件对其活动进行全程跟踪，并显示整个活动轨迹。当设定的训练时间已到或动物已爬上站台，计算机停止跟踪并记录下游泳轨迹和自动计算出动物在水池中所游过的路程，及找到站台所需的时间即潜伏期。用找到站台所需的时间表示大鼠的学习记忆能力。水池里的水面高出站台2cm，水温控制在（22±0.5）℃。实验在隔音安静的房间内进行，水池、日光灯、鼠笼等实验室各种物件的位置保持不变。实验采用一天训练2次，每次训练2min的方案。若动物2min尚未找到站台，将动物拿到站台上并使它在上面停留20秒。第3天进行水迷宫测试。

　　1.6.3 脑自由基代谢产物测定

　　取部分脑组织，用滤纸吸干水分后称重，迅速放入盛有碎冰块的小烧杯中冰浴，按体重体积比加预冷的生理盐水制备成10%的组织匀浆，3000rpm/min，离心15min，然后取组织匀浆上清再用生理盐水稀释成所需浓度，-70℃保存，待测。经考马斯亮兰测定组织蛋白，按试剂盒说明书分别测定脑组织SOD、MDA、GSHPx、NO、TChE、ATP酶活性，测定方法严格按照试剂盒说明书步骤进行。

　　1.7 统计学处理

　　 所有计量数据均表示差（x±s），采用SPSS11.0软件进行统计分析，检验方法采用Oneway ANOVA分析和t检验。

　　2 结果

　　2.1 对衰老大鼠一般情况的影响

　　空白对照大鼠毛色白而光泽、耳色红润、活动自如、反应性好、饮食正常、尿液和粪便色形正常；模型对照大鼠从半乳糖皮下注射2周后即开始出现自主活动减少、行动迟缓、精神不振、嗜睡、反应不灵敏、饮食量减少、被毛卷曲、枯黄、易脱落、光泽欠佳等现象；造模4周后，尾部出现色素斑点沉着斑点，并随着时间的推移而加重；给予抗衰老片、六味地黄丸和首乌延寿片后，异常的行为均有不同程度的缓解，如行动变得灵活，饮食增进，毛发较前润泽等。

　　2.2 对衰老大鼠体重的影响

　　与空白对照组比，模型对照大鼠体重增长明显缓慢（P<0.01），给予抗衰老片、六味地黄丸和首乌延寿片后，均能不同程度的减缓衰老大鼠的体重下降，与模型对照组比，抗衰老片高、中剂量组和首乌延寿片组大鼠体重增长变化率明显升高（P<0.05，P<0.01），见表1。表1 抗衰老片对衰老大鼠体重增长变化的影响（略）

　　与空白对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

　　2.3 对衰老大鼠水迷宫学习记忆能力的影响

　　与空白对照组比，模型对照组大鼠水迷宫探索路径长度、搜台潜伏期均显著延长（P<0.01）；给予高、中、低剂量抗衰老片、六味地黄丸和首乌延寿片后，均能不同程度的显著缩短衰老大鼠水迷宫中的探索路径长度和搜台潜伏期（P<0.01），见表2。表2 抗衰老片对水迷宫学习记忆能力的影响（略）

　　与空白对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

　　2.4 对脑自由基代谢的影响

　　2.4.1 对脑组织SOD活性、MDA含量和GSHPx活性的影响

　　与空白对照组比，模型对照大鼠脑组织SOD活性和GSHPx活性均明显降低（P<0.01），MDA含量明显升高（P<0.05），提示衰老大鼠的脑组织发生了脂质过氧化反应；给予高、中、低剂量的抗衰老片浸膏粉、六味地黄丸和首乌延寿片后，均能不同程度的显著升高衰老大鼠脑组织SOD和GSHPx活性，降低脑组织MDA含量（P<0.05，P<0.01），见表3。表3 抗衰老片对脑组织SOD、GSHPx活性和MDA含量的影响（略）

　　与空白对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

　　2.4.2 对脑组织Na+K+ATPase和Ca2+Mg2+ATPase活性的影响

　　与空白对照组比，模型对照大鼠脑组织Na+K+ATPase和Ca++Mg++ATPase活性均显著降低（P<0.05，P<0.01）；给予高、中、低剂量的抗衰老片、六味地黄丸和首乌延寿片后，均能不同程度的提高衰老大鼠脑组织中Na+K+ATPase和Ca++Mg++ATPase活性，但与模型对照组比较差异不显著（P>0.05），见表4。表4 抗衰老片对脑组织Na+K+ATPase和Ca++Mg++ATPase活性的影响（略）

　　与空白对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

　　2.4.3 对脑组织NO含量和乙酰胆碱酯酶（TChE）活性的影响

　　与空白对照组比，模型对照大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶（TChE）活性和NO含量明显升高（P<0.01）；给予高、中、低剂量的抗衰老片、六味地黄丸和首乌延寿片后，均能不同程度的显著抑制衰老大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶（TChE）的活性和NO含量（P<0.05，P<0.01），提示抗衰老片能提高衰老大鼠的学习记忆能力，见表5。表5 抗衰老片对脑组织NO含量和TChE活性的影响（x±s）U/（mgprot）（略）

　　3 讨论

　　SOD是体内最重要的过氧化分子清除酶，和GSHPx联合作用可有效防止组织细胞过氧化损伤［1］。MDA是体内脂褐素形成的中间产物，它能间接反映机体内的脂质过氧化水平［2］。通过皮下注射D半乳糖，在体内代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基和h3O2引起代谢紊乱，升高体内自由基水平，过氧化体内组织，能制作和自然衰老类似的亚急性衰老模型［3］。本实验结果显示，皮下注射D半乳糖后，模型大鼠脑内SOD、GSHPx和ATPase活性明显下降，MDA含量升高，提示大鼠抗氧化能力降低，脂质过氧化产物升高，符合衰老模型，且研究发现六味地黄丸可通过改善体内自由基代谢达到抗氧化、抗衰老的目的［4］，本实验结果亦证实给予抗衰老片后，能明显提高SOD、GSHPx和ATPase活性，降低MDA含量，表明抗衰老片具有抗脂质过氧化物的作用。

　　本实验结果显示，模型大鼠脑组织NO含量和乙酰胆碱酯酶（TChE）活性明显升高，提示衰老大鼠的学习记忆能力出现明显的障碍，与水迷宫空间记忆能力实验中探索路径和搜台潜伏期明显延长相一致。以往研究表明，六味地黄丸能逆转Dgal所致大鼠脑组织中胆碱酯酶活性和NO含量增加，改善学习记忆能力［5］，本实验结果亦证实，给予抗衰老片、六味地黄丸、首乌延寿片后能明显降低脑组织NO含量和TChE活性，缩短探索路径和搜台潜伏期，提示抗衰老片具有改善学习记忆能力的作用。

参考文献

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　　［3］张熙，李文彬，张炳烈.D半乳糖亚急性中毒大鼠拟衰老生化改变［J］.中国药理学与毒理学杂志，1990，4（4）：309310.

　　［4］周慧生.六味地黄丸延缓衰老作用的理论探讨［J］.光明中医，2006，21（10）：4546.

　　［5］朱坤杰，张建宁.六味地黄丸对D半乳糖所致衰老大鼠学习记忆的改善作用及机理［J］.中国实验方剂学杂志，2006，12（8）：4446.