曲张大隐静脉病理组织学变化及组织中诱导型一氧化氮合酶蛋白的表达

　　　　 作者：闫雷 朴金花 孙权 孙洁 李梅秀 钟震亚

【摘要】 　　目的 探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在曲张大隐静脉血管组织中的表达和意义。方法 临床手术剥离获取曲张大隐静脉曲张段、未曲张段各10例，正常大隐静脉8例，采用Weigert氏间苯二酚品红法、天狼猩红染色法测定各组弹性纤维及胶原纤维分布及变化；免疫组化法测定各组iNOS 蛋白表达，分析iNOS 蛋白表达与大隐静脉曲张发生的关系。结果 与正常对照组比较，曲张大隐静脉曲张段与未曲张段均出现管壁内弹性纤维断裂，分布不连续，排列紊乱，含量明显减少（P<0.05）；而胶原纤维的含量增加（P<0.05），且曲张大隐静脉曲张段中胶原纤维含量增加明显高于未曲张段（P<0.05）；iNOS蛋白在曲张大隐静脉曲张段组织中表达明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 大隐静脉曲张发生与大隐静脉管壁iNOS蛋白表达增高有关。

【关键词】 大隐静脉； 静脉曲张； 一氧化氮合酶（NOS） 诱导型一氧化氮合酶（iNOS）

　　有研究认为大隐静脉管壁的曲张主要是由于平滑肌细胞的分离、变性，而不是因为结缔组织成分的异常〔1〕，另有研究则认为胶原纤维的增多是造成大隐静脉曲张的重要原因〔2〕。一氧化氮(NO)是一个普遍存在的第二信使，性质活泼，半衰期短，因此关于NO的研究都集中在一氧化氮合酶(NOS)上。最新研究显示，在动脉瘤组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达增高，NO大量合成；NO直接参与弹力纤维的降解和新血管的形成，其机制为NO氧化生成高浓度的亚硝酸盐直接与弹力蛋白发生反应，导致其降解，促进动脉瘤的发生〔3〕。另有研究表明，精索静脉曲张患者精索内静脉NO含量明显升高〔4〕。而人曲张大隐静脉组织中iNOS表达的研究尚未见报道。本实验对比观察正常和曲张的大隐静脉组织中的iNOS蛋白的表达，从分子水平探讨iNOS与大隐静脉曲张发生的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 对象及分组

　　正常对照组：股动脉栓塞行高位截肢术患者（未进行大隐静脉动脉化治疗）8例；男6例，女2例，年龄69～82岁，术后取其正常大隐静脉8根。试验组为临床确诊大隐静脉曲张患者10例，男2例，女8例，年龄39～68岁。试验观察组Ⅰ：行高位结扎剥脱术剥离大隐静脉后取曲张段；试验观察组Ⅱ：行高位结扎剥脱术剥离大隐静脉后取未曲张段。取材过程避免人为损伤。选择2009年5～11月北京市朝阳医院血管外科住院病人，且诊断明确并有详细的病历记录。

　　1.2 方法

　　1.2.1 取材及固定

　　手术剥离获取大隐静脉，立即用中性甲醛固定，脱水包埋，石蜡切片，厚度约4 μm。同一标本平行切片3个，分别进行Weigert、天狼猩红染色和免疫组化染色。

　　1.2.2 Weigert氏间苯二酚品红法观察弹力纤维

　　常规脱蜡，入无水乙醇中2 min，95％乙醇2 min。将切片入上述配制的染液中染色20～60 min，95％乙醇分化，显微镜下控制，水洗，逐级酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。染液由北京市朝阳医院病理科配置。结果：弹力纤维呈深蓝色。

　　1.2.3 天狼猩红染色法观察胶原纤维

　　常规脱蜡，流水冲洗5 min，蒸馏水浸泡1 min。入天狼猩红苦味酸染色30 min。无水乙醇直接分化兼脱水。二甲苯透明，中性树胶封片。染液由北京市朝阳医院病理科配置。结果：胶原纤维呈红色，其他为黄色。

　　1.2.4 免疫组化染色（PV9000两步法）

　　iNOS免疫组化试剂购自武汉博士德试剂公司，按照试剂盒说明使用时1∶60稀释；AntiiNOS兔抗人多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗PV9000（工作液）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。结果：阳性部位呈棕色反应。

　　1.3 图像采集及分析

　　使用Leica DM4000B（德国）图像分析系统，所有染色切片低倍镜下观察，分别取0点、3点、6点、9点位，每一指标以同样的显微环境及拍摄条件20倍物镜下采集血管中层（肌层）图像，使用QwinV3图像分析系统行灰度分析，灰度分级：0～256级；4点灰度的平均值为每一张切片的灰度值；灰度值反映着色强弱，测量的灰度越小，阳性反应越强。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS16.0统计软件处理分析数据，检测数据以x±s表示，采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 弹性纤维及胶原纤维分布及变化

　　正常对照组：光镜下观察可见弹性纤维呈蓝黑色，胶原纤维呈红色，肌纤维呈黄色，正常的大隐静脉三层结构清晰，中膜弹性纤维呈连续的细丝波浪状，与平滑肌细胞、少量的胶原纤维呈多层环状分布；实验观察组Ⅰ和组Ⅱ与正常对照组比较，管壁内弹性纤维断裂，分布不连续，排列紊乱，含量明显减少（P<0.05）；而胶原纤维的含量增加（P<0.05），且实验观察组Ⅰ中胶原纤维含量增加明显高于实验观察组Ⅱ（P<0.05），见表1，图1，图2。

　　2.2 免疫组化检测结果

　　iNOS蛋白在平滑肌细胞胞浆中表达，呈黄色或棕黄色，细胞核呈蓝色（图3），与正常对照组比较，iNOS蛋白在曲张大隐静脉曲张段组织中表达明显增高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。表1 弹性纤维、胶原纤维及iNOS蛋白表达灰度(略)

　　3 讨 论

　　正常大隐静脉内、中、外膜都含有平滑肌，而以中膜环形平滑肌最为发达，其径向收缩保证了大隐静脉不至于过分扩张。胶原纤维的功能主要是维持管壁张力，而弹性纤维提供轴向的回缩牵引力，又提供径向的弹性牵引力，使大隐静脉不至于过分延长和扩张。因此，正常大隐静脉中平滑肌细胞、胶原纤维和弹性纤维的协同作用维持了静脉壁的形状和功能。

　　本研究显示，正常大隐静脉管壁弹性纤维呈波浪状，胶原纤维在中膜多集中于平滑肌细胞之间，成束的胶原纤维排列整齐，呈规则性排列。在曲张大隐静脉曲张段和未曲张段静脉管壁内，均出现内弹力层消失，弹性纤维失去正常时规则的束状环层的波浪状排列，弹性纤维分裂成大量小碎片，分散沉积于内膜、中层和外膜之间。中层内胶原纤维明显增多，失去正常规则的束状排列和均匀的厚度，使呈规则片状排列的环状平滑肌细胞破裂分解，曲张静脉管壁失去正常胶原和弹力纤维的规则结构。此结果与Wali等〔5，6〕研究结果一致。李运辉等〔7〕报道也显示曲张静脉上、中、下三段管壁均出现弹性纤维分离、断裂现象，中膜肌间胶原纤维增生，排列紊乱，不规则。

　　通过测量比较曲张大隐静脉曲张段和未曲张段管壁中弹性纤维和胶原纤维的灰度值显示，两组间弹性纤维的含量无差别，而胶原纤维的含量在曲张段明显高于未曲张段，此结果进一步印证支持了弹性纤维的改变在静脉曲张形成过程中要早于胶原纤维。在静脉曲张形成早期，由于弹性纤维的形态改变，其承受来自环行负荷的能力降低，因而发生了静脉壁的扩张，此时胶原纤维起到了一定的代偿作用。随病变的进一步发展，胶原纤维的形态和分布也发生了改变，只有当胶原纤维失去代偿作用时，血管壁承受环行和纵行负荷的能力都降低〔8〕，于是静脉壁进一步扩张的同时发生延长、扭曲，最终形成外观上的静脉曲张。
　　
　　iNOS在多种细胞中均有表达，在免疫反应细胞如巨噬细胞和中性粒细胞中表达，而且在多种哺乳动物细胞，包括成纤维细胞、角质化细胞、内皮和血管平滑肌细胞，以及非哺乳动物，包括昆虫和植物中均有表达〔9〕。iNOS在静息细胞内是不表达的，当细胞受到细胞因子或免疫微生物刺激时， iNOS催化合成非生理浓度的大量NO，产生一系列病理作用。NO是一个普遍存在的影响多种生理、病理过程的信号分子，存在于多种细胞中，如巨噬细胞、肝细胞、肌细胞、内皮细胞等。NO主要具有免疫调节、神经传递、血压生理调控和抑制血小板凝聚等生理功能。免疫功能、血流量、血小板凝集反应、神经传递和记忆等内环境稳定作用都普遍伴随有低水平的NO。而过多的NO通常伴随有炎症和免疫紊乱、疼痛、神经疾病、动脉粥样硬化和癌症等〔10〕。过多的NO可直接引起细胞毒性作用，与过氧化物一起导致过氧化，从而引起组织损伤〔11〕。本研究显示，与正常对照组比较，iNOS蛋白在曲张大隐静脉曲张段组织中表达明显增高，与弹性纤维的含量呈反比，而与胶原含量和平滑肌细胞分离变性呈正比。提示在大隐静脉曲张发生过程中，iNOS催化合成非生理浓度的大量NO可能是导致平滑肌细胞的分离、变性及弹性纤维崩解的重要因素，在大隐静脉曲张的发生中起重要作用，其具体作用机制有待于进一步研究论证。

参考文献

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　　3 殷尚炯，许百男 孙正辉.一氧化氮在实验性大鼠脑动脉瘤形成中的作用〔J〕.解放军医学杂志，2005;30(9):8135.

　　4 王淑秋，秦文波，王淑湘，等.精索静脉曲张与氧化应激的研究〔J〕.中华男科学，2004;(4)2602.

　　5 Wali MA，Eid RA.Changes of elastic and collagen fibers in varicose veins〔J〕.Int Angiol，2002；21(4):33743.

　　6 Wali MA，Dewan M，Eid RA.Histopathological changes in the wall of varicose veins〔J〕.Int Angiol，2003；22(2):18893.

　　7 李运辉，褚海波.曲张大隐静脉管壁病理改变与临床病期的关系〔J〕.实用医药杂志，2009；26(5)：69.

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　　10 Crowell JA，Steele VE，Sigman CC，et al.Is inducible nitric oxide synthase a target for chemoprevention〔J〕? Mol Cancer Ther，2003;2(8)：815.

　　11 Choe W，Kim S，Hwang TS，et al.Expression of inducible nitric oxide synthase in thyroidneoplasms：immunohistochemical and molecular analysis〔J〕.Pathol Int，2003；53(7)：434.