腺苷及缺血后处理对兔缺血再灌注心肌的保护作用

　　　　 作者：贺晓楠 李淑梅 王雪梅 陈宇

【摘要】 目的 探讨腺苷对缺血再灌注后心肌的保护作用，及其与缺血后处理的关系。方法 40只健康大耳白兔，随机分为对照组、拮抗剂组、缺血后处理组、腺苷治疗组4组，每组10只。制备在体兔心肌缺血再灌注模型，检测心肌收缩功能指标，测量心肌梗死范围，观察缺血再灌注即刻应用腺苷及缺血后处理对兔缺血再灌注后心肌的影响。结果 腺苷治疗组和缺血后处理组与对照组和拮抗剂组相比，再灌注之后左室内压峰值、左室内压最大上升速率和左室内压最大下降速率的恢复率差异有统计学意义（P＜0.05）；梗死范围均明显低于对照组和腺苷受体拮抗剂组（P<0.01）；心肌酶学LDH和CK含量较对照组和腺苷受体拮抗剂组明显降低（P<0.01）。结论 腺苷/腺苷受体途径是缺血后处理的重要途径之一，能够减轻缺血再灌注损伤，保护心肌。

【关键词】 缺血再灌注损伤；缺血后处理；腺苷

　动物试验证实腺苷在心肌缺血再灌注损伤中具有保护作用，可以缩小梗死面积，改善左室功能以及增加冠脉血流〔1，2〕。腺苷的缺血预适应作用已经比较明了，而关于腺苷在缺血后处理〔3〕中的作用国内外却鲜有报道，本研究旨在探讨腺苷对缺血再灌注后心肌的保护作用及其与缺血后处理的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　（1）实验动物：健康白兔40只，雄性，体质量2.0～2.5 kg（吉林大学动物中心提供）。（2）药物及主要试剂与仪器：25%乌拉坦（武汉博士德生物工程有限公司）；腺苷(adenosine，沈阳诺康医药有限公司) ；8苯基茶碱(8phenyltheophylline，Sigma公司)；红四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride，TTC)（上海化学试剂厂）；Evans蓝（申邦科技贸易有限公司）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，肌酸激酶（CK）试剂盒(上海申能德赛诊断技术有限公司)； DH140 型动物呼吸机（成都泰盟医学仪器实验厂）；RM6280多导生理记录和分析处理系统(成都仪器厂)；Olympus生物显微镜（日本）:FA2104电子天平（上海）；AP621G载波放大器（日本）；日立7060全自动生化分析仪 (日本)。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 动物模型建立

　　25%乌拉坦1 g/kg(4 ml/kg)经耳缘静脉注射麻醉后，背位固定。用肝素钠(1 ml/kg)抗凝，分离颈动脉，6F导管经颈动脉插入左心室，联接四导生理记录仪，监测左室内压，心电图导联线与兔四肢相联接入心电放大器，记录标准Ⅱ导联心电图。气管切开，连接动物呼吸机(潮气量21 ml，频率50次/min)。除毛，剥离股静脉以备静脉给药。沿胸骨正中做一长约5 cm的切口，切开皮肤、皮下组织，暴露胸骨。于胸骨左缘切开肌肉组织，结扎止血，靠近胸骨左缘切断 3、4、5 肋软骨，用 4 号丝线结扎肋间血管，以甲状腺拉钩拉开肋软骨，显露胸腔。轻轻提起心包膜，用解剖剪纵行剪开，暴露心脏。用止血钳将左心耳轻轻提起，找到冠状动脉前降支。用持针器持心外科 6.0 的尼龙缝线，在冠状动脉前降支穿一线，用内径为 0.5～0.8 mm 的硅胶管套线，束紧后在贴紧硅胶管的上端用止血钳夹紧线，造成心肌缺血。心电图出现明显的ST段抬高。每次都由同一人完成这一操作。放松止血钳，去掉硅胶管，抽出结扎线，原来结扎血管再通，缺血再灌注模型建立。
　　
　　1.2.2 实验动物分组

　　将40只白兔按体质量编号后，按随机数字表随机分为4组，每组10只。（1）对照组：缺血40 min，再灌注120 min。（2）拮抗剂组：:缺血前静脉滴注（静滴）非特异性腺苷受体拮抗剂8苯基茶碱30 ml(10 mg/kg)，持续30 min，余下步骤同缺血后处理组。（3）缺血后处理组：缺血40 min，再灌注2 min，缺血2 min，再灌注3 min，缺血2 min，再灌注5 min，缺血2 min，再灌注7 min，缺血2 min，然后再灌注95 min。（4）腺苷治疗组 ：缺血40 min，再灌注120 min ，缺血再灌注即刻静滴腺苷30 ml(0.3 mg/min)，30 min内滴完。拮抗剂组缺血前静滴8苯基茶碱30 ml，其余组缺血前静滴生理盐水30 ml作为平衡对照；腺苷治疗组缺血再灌注即刻静滴腺苷30 ml，其余组缺血再灌注即刻静滴生理盐水30 ml作为平衡对照。

　　1.2.3 指标检测

　　(1)心肌收缩功能指标记录和测量：通过压力换能器在记录仪上描记心电图，左室内压(LVP)曲线以及左室内压峰值(LVSP)，将LVP电信号输入微分器描记左室dp/dt曲线和正负dp/dtmax。所有图形数据存入RM6280分析处理系统中进行处理。 (2)心肌梗死范围的测量：于实验终点将左前降支重新阻塞，从左心室导管内推注2%Evans蓝3～4 ml，2 min后迅速剪下心脏，分离缺血区(无蓝色)和非缺血区(蓝色)，将缺血心肌以滤纸吸干，置于天平上称重，再将缺血区水平切成5～6片，每片厚1～2 mm，置入1%TTC磷酸缓冲液(pH 7.4)中37℃水浴10～15 min，再将坏死区(灰白色)和非坏死区(深红色)分离，滤纸吸干将非坏死心肌称重，梗死范围以坏死心肌占缺血心肌重量的百分比表示。（3）各组于冠状动脉再灌注后，取右心耳血2 ml，测定血中CK、LDH。采用速率法，在全自动生化分析仪上分别测定CK、LDH。

　　1.3 统计学方法

　　所有试验数据由SPSS12.0统计分析软件处理。计量资料以x±s表示，多组间比较行方差分析、q检验。

　　2 结 果

　　2.1 各组LVSP比较

　　各组缺血前LVSP差异无统计学意义（P>0.05），缺血40 min时LVSP与缺血前的比率(即恢复率)各组间差异也无统计学意义（P>0.05）。再灌注120 min时，缺血后处理组和腺苷治疗组LVSP的恢复率均高于对照组和拮抗剂组(均P<0.01)；而缺血后处理组与腺苷治疗组比较差异无统计学意义（均P>0.05）。见表1。表1 各组心肌缺血40 min，再灌注120 min时LVSP(略)

　　2.2 左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)和左室内压最大下降速率(dp/dtmax)

　　见表2、表3。缺血前，四组实验兔的左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)差异无统计学意义，缺血40 min和再灌注120 min时，缺血后处理组和腺苷治疗组±dp/dtmax的恢复率均高于对照组和腺苷受体拮抗剂组(P<0.01)。表2 不同处理组心肌缺血40 min，再灌注120 min时+dp/dtmax(略)表3 不同处理组心肌缺血40 min，再灌注120 min时dp/dtmax(略)

　　缺血前，四组实验兔的左室内压最大下降速率(dp/dtmax)无显著性差异，缺血40 min缺血后处理组和腺苷治疗组±dp/dtmax的恢复率均高于对照组和腺苷受体拮抗剂组(P<0.05)。再灌注120 min时，缺血后处理组和腺苷治疗组±dp/dtmax的恢复率均高于对照组和腺苷受体拮抗剂组(P<0.01)。

　　2.3 心肌梗死范围

　　见表4。腺苷处理组和缺血后处理组的坏死区质量、梗死范围与对照组和腺苷受体拮抗剂组相比较有统计学意义（P<0.01）。表4 不同处理组兔心肌梗死范围比较(略)

　　2.4 各组再灌注后LDH和CK含量比较

　　各组再灌注后，缺血后处理组和腺苷治疗组的LDH和CK含量均低于对照组和拮抗剂组(均P<0.01)。见表5。表5 不同处理组兔再灌注后LDH和CK含量比较(略)

　　3 讨 论

　　缺血再灌注损伤的病理生理机制极为复杂，目前认为与再灌注后细胞内Ca超载、氧自由基大量生成、微血管内皮细胞损伤及血管内皮细胞与白细胞/ 血小板之间相互作用等有关。

　　研究显示腺苷具有：①扩张冠状动脉，增加氧供；②负性变力、变时、变传导作用，而减少氧耗；③抑制内皮素释放；④ 抑制血小板聚集；⑤ 减轻再灌注心脏的钙超载；⑥ 减少脂肪分解和减轻中性粒细胞的激活，进而使超氧阴离子等氧自由基产生减少，改善局部心室功能并缩小梗死面积，从而保护了缺血再灌注损伤的心肌。

　　1999年，国内学者高峰等首先提出了缺氧后处理（hypoxic postconditioning）的概念。2000年，他们从急性心肌缺血再灌注模型的整体动物实验中观察到，缺血后处理有利于兔缺血后心脏恢复收缩功能、缩小心肌梗死范围，显著减少再灌注早期心律失常的发生率。Zhao〔4〕等在犬的在体急性缺血再灌注模型中证实了缺血后处理能改善缺血再灌注心脏的心功能，缩小梗死面积。

　　本实验通过检测四组模型的血流动力学、心肌梗死范围及LDH和CK含量等多种指标，观察腺苷及缺血后处理对兔心肌缺血及再灌注损伤的影响。本实验结果显示：在心脏缺血再灌注即刻静脉滴注腺苷和缺血后处理与对照组和拮抗剂组相比：（1）再灌注之后左室内压峰值、左室内压最大上升速率和左室内压最大下降速率的恢复率有显著差异（P＜0.01）。说明应用腺苷药物组和其他组相比心肌的收缩舒张功能有所好转。（2）梗死范围均明显低于对照组和腺苷受体拮抗剂组（P<0.01）；说明腺苷处理后可减少梗死面积。（3）心肌酶学LDH和CK含量明显降低（P<0.01）。均证明了腺苷和缺血后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，都可以明显改善缺血再灌注心肌的损伤，改善了左室功能，增加冠状动脉血流，改善心肌缺血，明显减少了梗死范围，同时实验结果表明缺血后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用能够被非特异性腺苷受体拮抗剂8苯基茶碱所阻断，证实腺苷/腺苷受体途径是缺血后处理〔5〕的重要途径之一。但要确定腺苷能否成为常规应用于临床再灌注治疗的疗效确切的药物，还需进一步深入探讨和研究。

参考文献

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　　2 Bliksoen M，Kaljusto ML，Vaage J，et al.Effects of hydrogen sulphide on ischaemiareperfusion injury and ischaemic preconditioning in the isolated，perfused rat heart〔J〕.Eur Cardiothorac Surg Aug，2008；34:3449.

　　3 Xi L，Das A，Zhao ZQ，et al.Loss of myocardial ischemic postconditioning in adenosine A1 and bradykinin B2 receptors gene knockout mice〔J〕. Circulation，2008；118:S327.

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　　5 Morrison RR，Tan XL，Ledent C，et al.Targeted deletion of A2A adenosine receptors attenuates the protective effects of myocardial postconditioning〔J〕.Physiol Heart Circ Physiol，2007；293:h35239.