山茱萸纳米水提液对衰老小鼠脑组织p66shc表达的影响

　　　　 作者：王明富 欧芹 朱贵明 王昭 冷莉莉

【摘要】 　　目的 探讨山茱萸制剂对自然衰老小鼠脑组织的磷酸化酪氨酸信号适配蛋白（66kilodalton isoform of shcgene products，p66shc）表达的影响。方法 人工饲养自然衰老小鼠11～12月龄36只、青年鼠8只，分6组：青年对照组、衰老对照组和给药组，给药组又分为山茱萸纳米水提液和醇提液的大剂量、小剂量组；各组给药30 d，然后断头取小鼠肝组织做超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测，RTPCR法测定小鼠脑组织p66shc的表达。结果 山茱萸纳米水提和醇提液给药组SOD活性与衰老对照组相比显著升高（P<0.01），而MDA含量和脑p66shc的表达显著降低（P<0.01）；山茱萸纳米制剂水提液小剂量、大剂量组和醇提液比较上述作用均更显著（P<0.01） 。结论 山茱萸能够明显降低衰老小鼠脑p66shc活性亚基的表达，从而影响p66shc活性起到延缓衰老的作用。山茱萸纳米水提取液小剂量组的作用优于山茱萸纳米醇提液各组。

【关键词】 山茱萸；p66shc活性；衰老小鼠；脑组织；纳米水提取液

　　磷酸化酪氨酸信号适配蛋白（66kilodalton isoform of shcgene products，p66shc)是近几年研究较多的基因，敲除某些动物p66shc基因可以延长生物个体的寿命〔1〕。该基因的研究将机体衰老与细胞信号转导联系起来〔2〕，成为衰老机制研究的新热点。在分子水平上，正常衰老过程中压力感受基因的表达也有所提高，说明氧化应激反应参与并促进衰老〔2〕。本研究观察自然衰老模型小鼠脑组织p66shc活性的变化及山茱萸纳米水提液对其的影响，研究脑组织p66shc表达是否与机体衰老过程直接相关，及山茱萸纳米水提液抗衰老作用的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　11～12月龄自然衰老小鼠36只，体重41～50 g，由佳木斯大学实验动物中心提供。衰老小鼠按体重随机分成5组，即纳米水提大剂量组8只、小剂量组7只；纳米醇提大剂量组6只、小剂量组7只；自然衰老组(自然对照组)8只；另外，青年小鼠3月龄8只（青年对照组），共计6组。动物自由饮食，室温（24±2）℃饲养，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、RTPCR试剂盒由大连宝生物公司提供，中药山茱萸在佳木斯医学药店购买。山茱萸常规粉碎机粉碎，球磨机研磨48 h制成纳米颗粒，分别用水和75%乙醇溶液浸泡36 h，过滤取上清液，旋转蒸发仪蒸发掉多余水分和乙醇，取终产物冻干保存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物饲养

　　纳米水提大剂量组、纳米水提小剂量组、纳米醇提大剂量组、纳米醇提小剂量组分别按照小剂量0.75 g·kg-1·d-1；大剂量1.50 g·kg-1·d-1灌胃，连续给药30 d后断头取小鼠脑组织以RTPCR法测定p66shc活性的表达，小鼠肝组织做SOD、MDA检测。

　　1.2.2 指标的测定

　　RTPCR法测定小鼠脑组织p66shc表达：Trizol法提取总RNA，用DU800检测OD值，选取OD值1.8～2.2范围内的总RNA作为模板进行反转录，取反转录产物94℃变性30 s，59.5℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环进行PCR反应，产物行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶（EB）染色，凝胶成像系统进行数据分析；肝组织采用电动玻璃匀浆器匀浆，离心去上清液进行SOD、MDA检测，采用分光光度法测定OD值。

　　1.3 统计学处理

　　数据用x±s表示，采用SAS法进行F检验，多重比较采用q检验。

　　2 结 果

　　2.1 不同剂量山茱萸组衰老小鼠肝脏SOD活性和MDA含量的变化 衰老对照组小鼠与其他各组相比SOD活性显著降低、MDA显著增加（P<0.01），纳米水提小剂量、大剂量组与纳米醇提大、小剂量组相比SOD活性显著增加（均P<0.01）；而MDA显著降低（均P<0.01）；但未达到青年对照组水平。见表1。表1 不同剂量山茱萸组衰老小鼠肝组织SOD、MDA含量的变化(略)

　　2.2 不同剂量山茱萸组脑组织P66shc的表达水平比较

　　衰老对照组小鼠脑组织p66shc的表达水平(1.532±0.09)较青年对照组(0.691±0.136)、纳米水提大剂量组(0.798±0.089)、纳米水提小剂量组(0.830±0.081)相比显著增高（P<0.01）；而纳米水提小剂量、大剂量组与纳米醇提大(1.157±0.263)、小剂量组(1.087±0.175)相比表达则显著降低（P<0.01）。

　　3 讨 论

　　大量的实验研究证明衰老的机体氧自由基含量明显升高。表面上看，氧应激和遗传在决定衰老的问题上是两个独立的事件，但越来越多的实验证据说明二者存在着本质的联系〔3〕。在分子水平上，正常衰老过程中压力感受基因表达有所升高，表明氧化应激参与并促进衰老，基因功能分析表明哺乳动物原癌基因shcA编码的p66shc蛋白可能是联系凋亡和衰老的交汇点〔2〕。p66shc作为一个细胞内活性氧( reactive oxygen species，ROS)浓度高低的感受器，进而促进细胞凋亡，调节细胞寿命。p66shc已被研究证明在细胞的氧化应激应答中起重要作用，它通过叉头转录因子家族调节胞内氧化还原平衡及凋亡。p66shc在氧化应激状况下调节磷酸化FoxO转录因子的活性，而磷酸化FoxO是PBKAKTFoxO信号转导途径中的环节。p66shc上的丝氨酸磷酸化位点的磷酸化状态直接影响着其信号适配功能，从而参与细胞的凋亡调控〔4〕。p66shc即是哺乳动物与生命周期密切相关的蛋白质，也是近年来研究细胞氧化应激反应的主要蛋白，它通过在线粒体内氧化细胞色素C产生大量活性氧导致细胞氧化损伤〔5〕。研究结果说明，山茱萸纳米制剂能够明显提高衰老小鼠肝细胞SOD活性、降低MDA含量，达到清除体内的氧自由基和保护细胞免受应激反应损害的作用。同时p66shc在衰老小鼠脑组织表达增加，而山茱萸可通过下调衰老小鼠脑细胞p66shc的表达，表现出对氧化应激的抗性〔1〕。但有的学者研究结果证明p66shc在百岁老人成纤维细胞中居然是高表达〔6〕，表明了p66shc基因与长寿的相关性及这种关系的复杂性〔7〕。但是，p66shc基因表达产物在氧化应激及在衰老与抗衰老过程中的重要作用值得进一步探索研究。山茱萸纳米制剂作用的研究结果表明，山茱萸纳米水提液不仅可以发挥良好的延缓衰老作用，而且可以降低药物的用药剂量，这对山茱萸制剂的进一步开发提供了重要的依据。

参考文献

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