作者：刘军权，陈复兴 ，巩新建，
张宝福，张颂，吕小婷，陶征中，李佚，张娟
【摘要】 目的 探讨舒林酸提高γδT细胞杀伤胃癌细胞的作用机制。方法 常规方法培养γδT细胞，收集培养第9天的γδT细胞用不同浓度的舒林酸(1、2、4、8、16、32 μmol/L)诱导24 h，收集培养上清液用于细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素12(IL-12)检测，沉淀细胞用于穿孔素、粒酶B、NKG2D流式细胞测定和用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测γδT细胞杀伤胃癌细胞株(SGC-7901和BCG-823)活性。每组测试样本和指标均设未加药物诱导的对照组。结果 舒林酸浓度在8 μmol /L时，γδT细胞穿孔素和粒酶B达最高〔分别为(71.5±5.3)%和(78.3±7.1)%〕，明显高于对照组〔分别为(51.4±7.3)%和(60.9±7.1)%〕。γδT细胞经不同浓度的舒林酸诱导后培养上清液中IL-12和TNF-α浓度没有差异;舒林酸在8 μmol/L时上清液中IFN-γ浓度达最高〔(246.1±20.7)ng/L〕，明显高于对照组〔(196.1±13.2)ng/L〕;当舒林酸浓度达32 μmol/L时，γδT细胞分泌的3种细胞因子明显低于对照组，两者比较有显著性差异(P<0.05)。γδT细胞经舒林酸诱导后杀伤SGC-7901和BCG-823细胞活性在8 μmol/L时达到峰值，此时对SGC-7901和BCG-823的杀伤活性分别为 (73.6±3.9)%和(76.3±3.9)%，与对照组〔(60.1±3.7)%和(59.2±4.5)%〕比较有明显差异(P<0.05)。结论 舒林酸诱导后γδT细胞杀伤SGC-7901和BCG-823活性明显增高的机制可能与γδT细胞表达穿孔素和粒酶B及分泌的IFN-γ有关。
【关键词】 γδT细胞;舒林酸;穿孔素;粒酶B;NKG2D;细胞因子;胃癌
Abstract: Objective To explore the mechanism of sulindac on the effect of human γδT cells against gastric cancer cells. Methods Routine culture γδ T cells were collected on the 9th day and then induced with sulindac at different concentrations (1， 2， 4， 8， 16 and 32 μmol/L， respectively). 24 hour later， the supernatants were collected for the detection of IFN-γ， TNF-α and IL-12. The sediments were used to detect the level of perforin， granzyme B and NKG2D by flow cytometry (FCM) as well as the cytotoxicity of γδT cell on the viability of gastric cancer cells (SGC-7901 and BCG-823) by lactate dehydrogenase (LDH) release assay. Results The expression level of perforin and granzyme B 〔(71.5±5.3)% and (78.3±7.1)%， respectively〕 of γδ T cells induced by sulindac at 8 μmol/L reached the peak， which was significantly higher than the control group 〔(51.4±7.3)% and (60.9±7.1)%， respectively〕. The expression of NKG2D was remarkably inhibited by sulindac and the increased with drugs. IFN-γ 〔(246.1±20.7)ng/L〕 secretion of γδT cells after sulindac induction was significantly higher than the control group 〔(196.1±13.2)ng/L〕， especially at the concentration of 8 μmol/L of sulindac. The amount of TNF-α and IL-12 secreted by γδ T cells induced by sulindac had no significant difference in contrast to the control group. The cytotoxicity of γδ T cells induced by sulindac at 8 μmol/L on the gastric cancer cells BCG-823 and SGC-7901 〔(73.6±3.9)% and (76.3±3.9)%， respectively〕 was significantly higher than the control group 〔(60.1±3.7)% and (59.2±4.5)%， respectively〕. Conclusion The enhancement of the cytotoxicity of γδ T cells induced by sulindac might be connected with the higher expression of IFN-γ， perforin and granzyme B from γδ T cells.
Key words: γδT cells; sulindac; perforin; granzyme B; NKG2D; cytokines; gastric cancer
许多研究认为，舒林酸(sulindac)不仅对家族性腺瘤性息肉病显示出独特的疗效，长期服用还能降低结肠腺癌的发生率、抑制早期癌症恶化[1]和显著抑制胃癌细胞生长。Yu等[2]研究发现，舒林酸对胃癌细胞株BCG-823有抑制作用，但是需要用900 μmol/L以上的舒林酸才能诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长。而舒林酸的临床常规服用药物剂量为0.2 g/8 h，根据换算，最高血药浓度仅为25.3 μmol/L(舒林酸：T1/2为2.8 h，生物利用度88%，口服0.2 g/8 h，达峰值时间tmax为1. 86 h，按一级动力学模型计算：ct=Co.e-ke，血药浓度为cmax=25.3 μmol/L)，此实验用药剂量是临床实际使用量的30倍，该结果明显不符合临床的用药实际。也进一步说明，舒林酸能够预防消化道肿瘤不仅是化学直接预防，也可能是与体内的某些成分合成新的有效物质或者在体内促进抗肿瘤效应细胞功能有关。
我们的前期研究发现，舒林酸能提高人γδT细胞杀伤肿瘤细胞活性[3]。而γδT细胞是广泛分布于消化系统、呼吸系统等黏膜和上皮组织内的固有免疫T细胞，具有抗原提呈、杀伤肿瘤细胞和免疫调节等作用[4-5]。γδT细胞的抗肿瘤效应除了有与αβT细胞类似的一些功能特征外，识别多肽抗原时无MHC限制，而且还能识别一些非多肽抗原，是一种新型的抗肿瘤效应细胞，具有很强的抗肿瘤活性[6]。有研究发现，γδT细胞的抗肿瘤机制可能与其表达的穿孔素、粒酶B和NKG2D受体及γδT细胞分泌的细胞因子有关。
为进一步探讨舒林酸促进人γδT细胞杀伤肿瘤细胞的作用机制，我们试用不同浓度的舒林酸在体外诱导人γδT细胞，观察舒林酸对人γδT细胞表达穿孔素、粒酶B、NKG2D和分泌γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素12(IL-12)的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 人胃腺癌细胞株SGC-7901、BCG-823，购自中国科学院上海细胞生物研究所。
1.1.2 主要试剂 胰蛋白酶、RPMI 1640(Gibco公司产品)，人AB血清(徐州市血站)，胎牛血清和淋巴细胞分离液(中国科学院血液病研究所)，异戊烯焦磷酸(isopentenylpgrophosphate，IPP)、舒林酸(Sigma公司)，IL-2(厦门特宝生物公司)，IFN-γ、TNF-α和IL-12酶免检测试剂盒(Bemder medsysterms公司)，FITC标记的抗人TCR-γδ和PE标记的穿孔素、粒酶B和NKG2D抗体均购自杭州联科生物(Immunotech， France)，乳酸脱氢酶试剂盒购于日本世诺临床诊断制品株式会社。
1.1.3 主要仪器 日立HITACHI 7600-101全自动生化分析仪;FACS Caliber流式细胞仪(BD公司)，流式细胞仪分析软件为CellQuest，每个标本分析细胞数≥1×104。
1.2 方法
1.2.1 γδT细胞的培养和鉴定 按文献[7]进行，取健康献血者末梢抗凝血用淋巴细胞分离液分离单个核细胞(PBMC)，PBMC经生理盐水常规离心洗涤3遍后，用含10%小牛血清、5%人AB血清、2×105 U/L IL-2和3 μg/L IPP的RPMI 1640培养液调整细胞密度为5×108个/L，置75 cm2细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱中培养，根据细胞生长情况添加培养液。收集培养9天的贴壁生长的细胞用流式细胞仪分析法进行细胞表面标志鉴定。
1.2.2 舒林酸对γδT细胞的诱导 取培养9天的γδT细胞，用无血清培养基洗涤3次后配成2×109个/L，加入6孔细胞培养板，5 ml/孔。然后分别加入不同浓度的舒林酸(终浓度分别为1、2、4、8、16、32 μmol/L)，37℃孵育24 h后收集细胞常规离心，取培养上清液和沉淀细胞进行相关指标的检测。
1.2.3 γδT细胞的穿孔素、粒酶B和NKG2D及细胞因子的检测 取上述经舒林酸诱导后的γδT细胞，培养上清液用于细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12检测，沉淀细胞用于穿孔素、粒酶B和NKG2D流式细胞测定。每测试样本均设未加药物诱导的对照组。细胞因子检测方法严格按试剂操作说明书进行。
1.2.4 γδT细胞杀伤活性检测 用本室建立的乳酸脱氢酶释放法[8]测定γδT细胞杀伤活性。取上述经舒林酸诱导后的γδT细胞(效应细胞)及常规培养至对数生长期的胃腺癌SGC-7901、BCG-823细胞(靶细胞)分别配成密度为2×109个/L和2×108个/L的细胞悬液。将效应细胞和靶细胞数按10∶1比例混合，每测试样本均设未加药物诱导的对照组。同时加设单靶细胞的自然释放组和单效应细胞的自然释放组。以500 r/min离心5 min，置37℃、5%CO2孵箱中孵育6 h后，轻轻混匀细胞，再以1 500 r/ min离心10 min，收集上清液在全自动生化分析仪340 nm波长下测定光密度(D)。
γδT细胞杀伤活性(%)=(D实验组-D效应细胞自然释放组)/(D靶细胞最大释放组-D靶细胞自然释放组)×100%
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行数据处理，数据以±s表示。组间比较采用Dunnett法单向方差分析。检验水准：α=0.05。
2 结 果
2.1 γδT细胞培养和鉴定 PBMC经9天培养后可见大的集落，单个细胞可见细胞呈条梭状。收集培养前后细胞，用FITC标记的抗人TCR-γδT荧光标记后经流式细胞仪检测结果为：培养前γδT细胞数为5.12%，培养9天 时γδT细胞数为91.27%。
2.2 舒林酸对γδT细胞穿孔素、粒酶B和NKG2D的影响 随舒林酸浓度增加，γδT细胞的γδTCR表达量、穿孔素、粒酶B表现为先增加后抑制的趋势;舒林酸浓度在8 μmol/L时，γδT细胞穿孔素和粒酶B的表达量最高。各浓度舒林酸均能抑制γδT细胞NKG2D的表达，并随着药物浓度的增加抑制作用越明显。见表1。表1 舒林酸对γδT细胞穿孔素、粒酶B和NKG2D的影响与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01
2.3 舒林酸对γδT细胞分泌的3种细胞因子的影响 随舒林酸浓度增加，IL-12和TNF-α浓度逐渐降低，表现出高浓度抑制趋势;IFN-γ表现为先增加后抑制的趋势，舒林酸在8 μmol/L时IFN-γ浓度最高。当舒林酸浓度达32 μmol/L时，γδT细胞分泌的3种细胞因子均明显低于对照组，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.4 舒林酸对γδT细胞杀伤活性的影响 γδT细胞经不同浓度的舒林酸诱导24 h后，杀伤SGC-7901和BCG-823细胞作用随药物浓度增加而逐渐增强，在8 μmol/L时达到峰值;当舒林酸浓度继续升高时， γδT细胞对2种肿瘤细胞株的杀伤活性则逐渐降低。结果见表3表2 舒林酸对γδT细胞分泌3种细胞因子影响与对照组比较：*P<0.05表3 舒林酸对γδT细胞杀伤胃癌细胞活性的影响与对照组比较：*P<0.05
3 讨 论
我们在前期实验中发现[3]，舒林酸(浓度在10 μmol/L以内)能促进γδT细胞增殖和提高其杀伤活性;但是浓度达20 μmol/L时，γδT细胞开始出现生长抑制，杀伤活性也明显减低;当舒林酸浓度升至50 μmol/L时，对γδT细胞的抑制率可达39%，此时的杀伤活性也明显低于对照组。说明舒林酸对人γδT细胞功能影响有浓度窗现象。
本实验结果发现，人外周血中培养的γδT细胞经低浓度舒林酸诱导后，其穿孔素、粒酶B明显高于对照组，对SGC-7901和BCG-823细胞株的杀伤活性也明显增高，且趋势相同(均在舒林酸8 μmol/L时达峰值)。提示经舒林酸诱导后γδT细胞杀伤胃癌SGC-7901和BCG-823细胞株活性明显增高的机制可能与γδT细胞表达较高数量的穿孔素和粒酶B有关。
穿孔素是存在于细胞毒性T细胞、NK细胞和γδT细胞胞质的细胞毒颗粒中，当这些细胞与靶细胞接触后可释放穿孔素，在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道，导致靶细胞溶解破坏[9]。粒酶B[10]是杀伤性T细胞颗粒中最重要的丝氨酸蛋白酶，可通过多种途径杀伤靶细胞。NKG2D主要作用是将受到感染或损伤的细胞通过中间受体将信号传导至机体的免疫系统，诱导机体产生免疫应答[11]。本实验中各浓度舒林酸均能抑制γδT细胞NKG2D的表达，并随着药物浓度的增加抑制作用越明显，其原因有待从细胞信号转导、细胞分子生物学等方面进一步研究。
虽然经某些浓度的舒林酸诱导后γδT细胞表达穿孔素、粒酶B有显著性增高，但是在相应浓度舒林酸诱导后的γδT细胞杀伤SGC-7901和BCG-823活性并无非常显著的增强，可能为γδT细胞表面NKG2D表达减低有关。因为效应细胞表面的NKG2D受体与肿瘤细胞表达的NKG2D配体(MICA)与γδT细胞杀伤敏感性高度相关。
Sakaeda等[12]报道， 舒林酸对IFN-γ有调节作用，本研究也发现，经舒林酸(4、8 μmol/L)诱导后的γδT细胞分泌IFN-γ量明显高于对照组。高含量的IFN-γ可在淋巴结内诱导T细胞活化，从而增强机体的免疫监视和免疫防御功能。但是经舒林酸诱导的γδT细胞对TNF-α和IL-12分泌无明显作用，说明舒林酸对γδT细胞细胞因子网络为选择性影响。
综合以上结果分析认为，经舒林酸诱导后γδT细胞杀伤SGC-7901和BCG-823活性明显增高的机制可能与γδT细胞表达较高浓度的穿孔素和粒酶B及分泌的IFN-γ有关。这些结果从细胞免疫方面为舒林酸能够防治胃癌提供了一定的实验依据。
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