新生鼠坏死性小肠结肠炎肠细胞凋亡率变化及意义

　　　　 作者：董海英， 刘健， 陈兢芳， 卓玲， 杨燕珍， 吴斌

【摘要】 　　目的 探讨新生鼠坏死性小肠结肠炎(NEC)肠细胞凋亡率变化及其与肠组织损伤程度的关系。 方法 出生48 h的SD大鼠16只随机分成模型组和对照组，每组8只。模型组给予鼠乳代用品人工喂养，100%氮气缺氧90 s，4 ℃冷刺激10 min，每天2次，连续3 d，建立NEC模型；对照组与母鼠同笼，鼠乳喂养，未进行缺氧冷刺激。实验结束后24 h处死大鼠，留取十二指肠下端至直肠上端肠道组织进行肠组织损伤评分和肠细胞凋亡率检测。每组随机抽取2例回盲部近端小肠进行肠黏膜透射电镜检查。 结果 模型组肠组织学改变与NEC时改变一致，透射电镜显示肠黏膜出现大量凋亡细胞，部分形成凋亡小体。模型组和对照组肠组织损伤评分分别为（3.33±0.59）和（0.13±0.17）；肠细胞凋亡率分别为（31.0±10.6）%和（4.6±3.9）%；二者比较差别均有统计学意义。肠细胞凋亡率与肠组织损伤评分呈显著正相关(r=0.771，P<0.01)。 结论 NEC时肠细胞凋亡明显增加。肠细胞凋亡可能是造成新生鼠NEC肠道进行性损伤的病理基础。

【关键词】 小肠结肠炎，伪膜性； 婴儿； 新生，疾病；疾病模型，动物； 细胞凋亡

　　坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生儿时期严重的肠道炎症性疾病，是新生儿重症监护病房中最常见的外科急症。虽然大量研究证实NEC发病与早产、肠管缺氧缺血、肠内喂养、细菌感染等有关，但其确切发病机制仍不明确[12]。近年来研究证实，胃肠道屏障功能受损是胃肠功能障碍发生的病理基础，是多种严重疾病和器官损伤的共同病理生理过程；其中，胃肠上皮细胞结构的完整是维持其屏障功能的形态学基础，肠上皮细胞及细胞间相互连接紧密程度及其完整性决定肠黏膜屏障通透性[2]。本研究通过人工喂养、缺氧和冷刺激复制新生大鼠NEC模型，采用流式细胞仪检测肠细胞凋亡率，结合肠组织损伤评分、肠黏膜电镜观察，探讨新生大鼠NEC发病过程中肠细胞凋亡率变化及其与肠损伤的关系，为阐明NEC的发病机制、寻找直接有效的治疗药物提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及分组 清洁级新生SD大鼠16只，出生<48 h，购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK(沪)20070005]。剔除每胎>12只或每胎<6只者。每窝5～6只，雌雄不限，体质量5～10 g。生后48 h随机分成模型组和对照组，每组各8只。模型组新生大鼠与母鼠分开，置入保育箱中，采用鼠乳代用品人工喂养，100%氮气缺氧90 s，4 ℃冷刺激10 min，每天2次，连续3 d，建立新生鼠NEC动物模型[3]；对照组继续与母鼠同笼，鼠乳喂养，未进行缺氧冷刺激。NEC模型组在造模结束后24 h和对照组新生鼠空腹断头处死，打开腹腔取出十二指肠下端至直肠上端的肠道组织。

　　1.2 主要试剂 雅培加营素蛋白质粉由美国雅培公司提供；低出生体质量婴儿配方奶粉由雀巢公司提供；中/长链脂肪乳注射液(C6～24)购自华瑞制药有限公司。胃蛋白酶(美国Sigma 公司)；Aanxin V/PI试剂盒(美国贝克曼公司)。根据实验要求，自制新生鼠保育箱，保育箱内环境温度、湿度用Hygro电子温湿度计24 h监测。

　　1.3 方法

　　1.3.1 病理学检查 取回盲部近端肠管1 cm置于10%甲醛中固定，石蜡包埋，取冠状切面，HE染色后在光镜下观察肠组织形态学改变。采用双盲法进行肠组织损伤评分。参照文献[1，3]分为4级：0分为正常，1分为轻微黏膜下和或固有层分离，2分为中度黏膜下和/或固有层分离和/或黏膜下和肌肉层水肿，3分为严重黏膜下和/或固有层分离和/或黏膜下和肌肉层水肿、局部绒毛脱落，4分为肠绒毛消失伴肠坏死；组织学评分≥2分确定为NEC。每一例新生鼠回盲部肠组织标本观察3个视野，取其平均值。

　　1.3.2 凋亡率检测 除留取回盲部远端结肠1 cm用于常规病理检查及肠组织损伤评分外，将其余所有肠管(从十二指肠下端至直肠上端肠道组织)用于肠细胞凋亡检测。剖开肠管，棉签小心清除粪便，用冰生理盐水漂洗1～2遍，再用PBS液漂洗至肠管干净。剪成1 mm×1 mm×1 mm，置于300目金属网筛，用玻片轻搓至匀浆状，接着用PBS液将匀浆状的肠组织冲洗至烧杯中。网筛过滤2次后，将细胞悬液置于15 mL的离心管中1 000 r/min离心10 min，弃上清，剩1 mL细胞悬液，加入0.2%胃蛋白酶0.9 mL吹打2 min，加入生理盐水2 mL，1 000 r/min离心10 min，弃上清，剩余细胞悬液加入生理盐水至0.5 mL，将0.5 mL细胞悬液加入Anneix VFlous标记液室温孵育20 min后流式细胞仪(EPICS XL型，USA)检测，记数10 000个肠细胞检测凋亡细胞数。FCM凋亡图的读取：结果分为4个象限，分别表示活细胞、坏死细胞、凋亡细胞、受损细胞，经计算机处理，得到绝对数和百分率。

　　1.3.3 透射电镜检查 每组随机抽取2例回盲部近端小肠1 cm，剖开，冰生理盐水漂洗干净后，3%戊二醛1.5%多聚甲醛前固定数天(或数小时)(4 ℃)，1%锇酸1.5%亚铁氰化钾后固定1.5 h，PBS漂洗；70%酒精饱和醋酸铀染液块染，酒精丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋剂包埋。超薄切片80 nm，醋酸铀、柠檬酸铅各染色5 min；在日立Hu12A型或飞利浦EM 208型透射电镜下观察上皮细胞紧密连接、微绒毛改变，肠上皮细胞凋亡改变。

　　1.4 统计学处理 实验结果以x±s表示，采用SPSS 11.0统计学软件进行统计学分析。α=0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 外观表现及生长情况 造模后，NEC模型组新生SD大鼠相继出现腹泻、腹胀、活动减少，外观消瘦，随缺氧冷刺激次数的增加，上述表现逐渐明显。对照组新生SD大鼠进食及排便均正常，无腹胀及胃潴留，活动度良好，皮下脂肪丰满。

　　2.2 病理改变 对照组回肠部结构完整，肠黏膜完好，上皮完整、连续、腺体排列规则，组织结构清楚、分泌功能活跃、固有层血管无扩张，肌层无异常，无炎性细胞浸润及溃疡(图1A)。NEC模型组回肠部肠黏膜和黏膜下层充血、水肿，固有层较多中性粒细胞浸润，少数可见黏膜上层脱落(图1B)；严重者出现绒毛脱落、坏死，绒毛结构消失，甚至肠穿孔；固有层多量淋巴细胞、巨噬细胞及中性粒细胞浸润(图1C，D)。

　　A:对照组;B～D:模型组. A:肠结构正常，肠组织损伤评分0分;B:肠黏膜和黏膜下层轻度水肿，肠组织损伤评分2分;C:肠黏膜和黏膜下层水肿明显，局部绒毛脱落，肠组织损伤评分3分;D：肠黏膜和黏膜下层水肿明显，绒毛坏死脱落，结构消失，肠组织损伤评分4分.
　　
　　图1 坏死性小肠结肠炎大鼠回盲部肠组织病理学改变(HE染色， ×200)（略）

　　Fig 1 Histopathological changes in the intestine of NEC rats(HE staining， ×200)

　　2.3 透射电镜观察 对照组新生大鼠肠黏膜上皮细胞形态完整，细胞核与细胞器清晰可见，细胞核呈圆形，核内染色质均匀，结构未见异常，表面微绒毛排列整齐；细胞紧密连接清楚，无增宽(图2A)。模型组新生大鼠肠黏膜出现大量的凋亡细胞，表现为细胞皱缩、变小，细胞质致密，细胞器相互靠近，核固缩，染色质浓缩，沿着核膜排列，形成不同形状和大小的块状，有些已形成了凋亡小体(图2B)；同时，微绒毛破坏严重，线粒体见水肿、嵴减少或消失，细胞间紧密连接破坏，细胞器发生浓缩(图2C，D)。

　　2.4 肠组织损伤评分及细胞凋亡检测 模型组和对照组肠组织损伤评分、肠细胞凋亡检测结果见表1；KruskalWallis H检验2组肠损伤组织评分、肠细胞凋亡率差别有统计学意义。以肠细胞凋亡率为一变量，肠组损伤评分为另一变量，进行非参数Spearman等级相关分析，结果显示，肠细胞凋亡率与肠组织损伤评分呈显著正相关关系（r=0.771，P<0.01）。

　　3 讨论
　　
　　肠黏膜细胞结构破坏是肠功能障碍发生的病理基础，也是多种严重疾病和器官损伤的共同病理生理过程。肠黏膜受到早产、肠管缺氧缺血、肠内喂养、细菌感染等损伤刺激后引起的损伤导致肠细胞坏死，在NEC初期仅表现为黏膜层损伤，后期则表现为整个肠壁透壁性坏死。传统观念认为，新生儿NEC导致的肠黏膜损伤是坏死；研究证实，虽然末期NEC组织病理学表现为典型肠组织广泛坏死，但在疾病完全发展之前，肠细胞凋亡可能是起始的肠黏膜细胞主要死亡方式，肠细胞凋亡改变可能导致其易于罹患NEC[12]。Clark等研究显示，表皮生长因子可保护肠道上皮细胞免于凋亡，从而减少新生鼠NEC发病率[4]。Feng等研究显示，给予肝素表皮生长因子可能通过下调肠细胞凋亡，维持肠黏膜屏障完整性，从而降低新生鼠NEC发病率和严重性[5]。Jilling等研究表明，配方奶喂养结合寒冷与缺氧冷刺激新生鼠小肠导致组织学改变与NEC时组织学改变一致；与母乳喂养的对照组相比，NEC模型组新生鼠肠黏膜有明显细胞凋亡存在，肠细胞凋亡是最早的大体形态变化，给予caspase抑制剂则可明显减少肠细胞凋亡率和NEC发病率，这表明新生鼠肠黏膜细胞凋亡是引起NEC模型肠道组织坏死的一个根本病因[6]。但也有学者对此提出异议。Wang 等报道，3月内处于生长发育阶段的大鼠肠细胞以增生为主，很难在正常肠黏膜组织检测到凋亡细胞[7]；Chih等采用TUNEL方法定量检测肠细胞凋亡，对缺血再灌注(I/R)损伤后新生鼠与成鼠肠道抵抗凋亡能力进行比较，结果显示，与对照组相比，缺血组和I/R组肠黏膜隐窝细胞中TUNEL阳性的细胞数明显增加；在成鼠再灌注30 min后肠黏膜隐窝细胞中，TUNEL阳性细胞达高峰，然后逐渐减少；与成鼠相比，I/R后新生鼠肠黏膜隐窝细胞中TUNEL阳性细胞明显较少[8]。笔者认为，肠道I/R损伤，特别是在再灌注过程中，细胞凋亡激活；细胞凋亡可能是I/R后导致细胞死亡的主要方式，新生鼠肠道对I/R有更强耐受性。本研究结果显示，NEC模型组肠组织学改变与NEC时改变一致，而母乳喂养的对照组肠组织未见有明显改变；NEC模型组新生大鼠肠黏膜电镜观察可见上皮细胞呈现凋亡的特征性改变；NEC模型组和对照组肠细胞凋亡率、肠组织损伤评分比较差别有统计学意义，肠细胞凋亡率与肠损伤评分呈显著正相关。这与Wang等和Chih等的报道不完全相同，而与国外大多数文献报道一致[2，46]。表明新生鼠发生NEC时胃肠道细胞凋亡增加，肠细胞凋亡率与肠组织损伤程度呈显著正相关。提示细胞凋亡与NEC发病机制有关，新生鼠肠细胞凋亡增加是NEC肠组织损伤起始事件，是重要的并可能是主要的导致细胞死亡的方式；肠细胞凋亡增加是造成新生鼠NEC肠道进行性损伤的病理基础，同时，肠细胞非正常凋亡增加可以增加肠黏膜通透性，启动从细菌移位到多脏器功能障碍的恶性循环，是肠黏膜屏障功能受损的关键现象。

　　A:对照组;B～D:模型组. A:肠黏膜上皮细胞形态完整，细胞核清晰，微绒毛排列整齐，细胞紧密连接清楚(×4 000);B:肠黏膜出现大量凋亡细胞，形成凋亡小体(×3 600);C:微绒毛破坏，线粒体水肿，嵴减少消失(×9 000);D:细胞间紧密连接破坏，细胞器浓缩(×6 300).

　　图2 坏死性小肠结肠炎小鼠肠黏膜超微结构变化（略）

　　Fig 2 The intestine mucosa changes in electron microscopy of NEC rats

　　表1 坏死性小肠结肠炎小鼠模型组和对照组肠组织损伤评分、肠细胞凋亡检测（略）

　　Tab 1 Changes of intestinal histopathological scores and apoptosis ratio of intestinal cells in the NEC group and control group

　　n=8. 与对照组比较，☆:P<0.01.

参考文献

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