实时荧光定量PCR检测传代培养细胞Grb10的表达

　　　　　　 作者：杨晓煜， 姚建凤， 黄燕芳， 张孟璋

【摘要】 　　目的 建立一种可靠的Grb10印迹基因实时荧光定量PCR方法，检测传代培养鼠尾成纤维样细胞中Grb10表达的差异。 方法 通过实时荧光PCR，选择合适的“相对标准品”绘制相对标准曲线，检测传代培养细胞中印迹基因Grb10的表达水平。结果 相对标准曲线有较好的线性（r=0.999及0.984）；实时荧光定量PCR方法检测出随着细胞培养代数的增加印迹基因Grb10表达水平上升。 结论 双标准曲线的实时荧光定量PCR法用于检测Grb10的表达准确可靠；传代培养可能影响鼠尾成纤维样细胞中印迹基因Grb10的表达水平。

【关键词】 聚合酶链反应； 等位基因； 基因表达； 蛋白质类； 细胞，培养的； Grb10

　　Grb10是母本等位基因特异表达的印迹基因，通过编码特殊的衔接蛋白结合酪氨酸激酶受体，调节特定的信号传递过程。印迹基因表达的一个特点是依赖等位基因的亲本来源，即优先表达来自父本或母本的等位基因[1]。某一亲本等位基因的沉默是通过染色体的表观遗传修饰来完成的，染色体的修饰对基因转录密不可分，主要包括DNA甲基化和组蛋白修饰。因此，检测小鼠印迹基因Grb10在经体外培养后表达水平的差异，是研究培养过程中表观遗传修饰影响印迹基因Grb10表达水平的重要基础。
　　
　　实时荧光定量PCR是近年来使用的一种核酸检测技术，因高精确度、高灵敏性、污染少等优点已在生物医学、基础科研及医学临床中得到广泛应用。它是利用每一模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存着的线性关系，来定量模板初始拷贝数，从而实现极为精确的核酸定量检测。综合比较实时荧光PCR绝对定量和相对定量的各种方法，同时结合试验目的，笔者采用一种新的实时荧光定量PCR的方法来检测印迹基因Grb10的表达，即通过合适的相对标准品、系列稀释后构建相对标准曲线，获得与绝对定量标准曲线一致的斜率。因为定量结果只与曲线的斜率相关[2]，因此，可以实现比传统的相对定量法（2-△△ C T法）更为准确的定量结果，并且避免了绝对定量的复杂度和难度。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 杂交鼠B6D2F1(C57BL/6 x DBA2，6～8周龄)，购自国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心[合格证号：SCXK（沪）20030003]。细胞培养用试剂购自上海水源生物技术服务公司。逆转录试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司（ReverTra AceαTM， TOYOBO）。SYBR Green I荧光定量试剂盒购自大连TaKaRa公司(SYBR Premix Ex TaqTM TaKaRa)。其余试剂无特别说明均购自美国Sigma公司。
　　
　　定量PCR的Grb10、Gapdh引物均由上海生工生物工程技术服务公司合成。RNA定量采用紫外分光光度计（ND100，美国Thermo公司），实时定量采用实时荧光定量 PCR仪（7500，美国ABI公司）。

　　1.2 鼠尾成纤维样细胞培养 参照文献[3]。剪约1 cm鼠尾组织，消毒后用培养液反复冲洗，转移至新培养皿，剪切至约1 mm×1 mm×1 mm组织块，移入湿润过的培养瓶，均匀摆布至瓶底，相互距离约0.5 cm。轻轻翻转培养瓶，瓶底向上，加入1 mL培养液（DMEM/F12，添加10%FBS和0.1～0.25%双抗），轻晃动使之分布均匀，置36.5 ℃温箱倒置培养约4～8 h，待其组织块贴壁，再缓缓把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖已贴附瓶底的组织块。培养约1周后，可见成纤维样细胞从组织块游离长出，适当添加培养液，获得原代成纤维样细胞。待其长满至约80%瓶底，连续传代过程中收集P1及P5细胞。

　　1.3 总RNA的提取与cDNA的合成

　　1.3.1 总RNA的提取与定量 收集P1及P5细胞，重悬、计数、离心（1 200 r/min，5 min），沉淀中加入Trizol，吹打后加入三氯甲烷，离心（1 200 r/min，5 min），沉淀加入丙醇；离心（1 200 r/min，5 min），乙醇洗涤，得到的RNA用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，用紫外分光光度计定量，-80 ℃保存。

　　1.3.2 cDNA合成 选择完整性良好的RNA样本，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。20 μL体系中含总RNA 100 ng，5×缓冲液 4 μL，dNTP mix（10 mmol/L）2 μL，抑制剂(10 mol/μL) 1 μL，逆转录酶 1 μL，Oligo(dT) 1 μL，最后无RNA酶h3O至20 μL。逆转录程序为：42 ℃ 20 min→99 ℃ 5 min→4 ℃ 5 min，cDNA放-20 ℃待测。

　　1.4 实时荧光定量RTPCR

　　1.4.1 相对标准品构建 取2 μg待测样本RNA逆转录成cDNA，5倍系列稀释后，得到标准品梯度浓度设为1，0.2，0.04，0.008，0.0016，相对标准品用于制作双标准曲线的模板。

　　1.4.2 实时荧光定量 PCR 使用扩增仪，按照试剂盒说明书进行，在20 μL反应体系中含2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL（内含TaKaRa Ex TaqTM HS，dNTP mix，Mg2+和SYBR Green I），50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μmol/L，待测样本的cDNA或梯度浓度的定量模板。引物大小及其序列（5’→3’）：

　　Grb10（315 bp）
　　
　　上游：CACGAAGTTTCCGCGCA
　　
　　下游：AGTATCAGTATCAGACTGCATGTTG

　　Gapdh（150 bp）
　　
　　上游：TGTGTCCGTCGTGGATCTGA
　　
　　下游：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG

　　1.4.3 PCR反应条件 95 ℃ 10 s→95 ℃ 5 s→60 ℃ 34 s，40个循环；95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s。各待测样本及各梯度浓度的相对标准品均做2个平行管，荧光定量分析软件自动绘制扩增动力曲线溶解曲线。通过溶解曲线分析实时荧光定量 PCR反应产物的纯度以判断实验的特异性。PCR反应结束后根据荧光定量分析软件，算出各待测样品的相对初始拷贝数。

　　1.4.4 验证PCR扩增产物 采用琼脂糖凝胶电泳法，并于紫外灯下观察扩增片段大小及特异性。

　　1.5 统计学处理 数据以(x±s)表示，采用SPSS Ver 13.0软件。配对样本t检验。

　　2 结果

　　2.1 电泳鉴定总RNA的完整性 RNA电泳可见3条rRNA条带，分别为28，18，5.8 S(5 S)，在紫外灯下亮度依次为28 S>18 S>5.8 S(5 S)，且28 S的亮度大致是18 S的2倍，5.8 S条带弱（图1）。可以认为所提取的RNA质量好，未被降解，可用于实时荧光定量PCR分析。

　　图1 RNA的电泳结果（略）

　　Fig 1 The results of RNA electrophoresis

　　2.2 实时荧光定量PCR反应 （1）实时扩增曲线（图2）。S型的扩增动力曲线，有明显的指数扩增期、有平台期，并且曲线起峰约在CT值为21，整条曲线走行光滑，显示扩增结果理想。（2）溶解曲线（图3）。分别显示目的基因Grb10和内参基因Gapdh PCR扩增后的溶解曲线，其熔点峰分别位于88.6 ℃和85.9 ℃，峰形窄而尖，无杂峰，扩增产物特异性良好。（3）标准曲线（图4）。显示5倍梯度稀释的相对标准品进行PCR扩增后，各自得到目的基因Grb10和内参基因Gapdh标准曲线，直线拟合度良好，斜率(slope)分别为-3.2062和-3.4673，其直线相关系数（r）分别为0.9838和0.9987，直线相关性好，可在较宽广的范围内进行定量分析。

　　横坐标为循环数，纵坐标为荧光强度.

　　图2 实时荧光定量PCR扩增曲线（略）

　　Fig 2 Application curve in Realtime PCR

　　2.3 确认PCR产物 于315 bp和150 bp处可见2条清晰电泳条带，与理论值大小一致，其分别为目的基因Grb10和内参基因Gapdh，此外未见其他杂带（图5）。

　　2.4 定量分析结果 通过内参基因Gapdh定量结果对目的基因Grb10定量值进行归一化处理后，以Grb10/Gapdh比值（K）表示基因Grb10表达水平，得到各样本K值见表2。体外传代培养过程中的鼠尾成纤维样细胞（P1和P5），其Grb10 表达水平分别为（1.5101±0.1074）和（1.7326±0.0735），二者比较有统计学意义（P=0.042）。

　　a：Grb10；b：Gapdh. 横坐标为温度（℃），纵坐标为荧光变化速度

　　图3 目的基因Grb10和内参基因Gapdh溶解曲线（略）

　　Fig 3 Dissociation curve for Grb10 and Gapdh

　　a：Grb10; b：Gapdh. 横坐标为相对表达量（对数显示），纵坐标为Ct值.

　　图4 目的基因Grb10和内参基因Gapdh标准曲线（略）

　　Fig 4 Standard curve for Grb10 and Gapdh

　　图5 电泳示PCR产物（略）

　　Fig 5 PCR products showed by DNA electrophoresis

　　表 2 Grb10 相对表达水平（略）

　　Tab 2 Relative expression of Grb10

　　A，B，C：来源于3只不同个体小鼠的鼠尾组织植块培养法得到的成纤维样细胞.

　　3 讨论
　　
　　传统的相对定量法是用2-△△ C T来计算实验组相对于对照组目的基因表达的变化倍数，其前提条件是各反应管扩增效率一致且PCR扩增效率接近100%，但在实际中，目的基因和内参基因的扩增效率不可能完全相同，对定量结果的分析产生影响；同时，扩增效率往往随着循环数的增加、引物和底物浓度的降低而下降；反复热变性使DNA酶活性降低，也会导致扩增效率下降，诸多存在因素决定实际PCR扩增效率不可能达到100%，并且会低于0.6[45]。因此，为克服2△△ C T的定量结果与实际结果之间的差距，在实验中笔者应用一种新的实时荧光定量PCR法，分析传代培养细胞印迹基因Grb10相对表达水平。与传统PCR相比，实时荧光定量PCR可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，更快速、灵敏地对待测样本mRNA进行定量或半定量分析。
　　
　　新的实时荧光定量PCR法是通过双标准曲线法进行半定量分析，以“相对标准品”代替绝对定量中的“绝对标准品”，设定各梯度浓度的相对标准品拷贝数为n、5n、25n、125n、625n (n>0)。同时，为避免同一管扩增中目的基因和内参基因扩增是对模板和原料的竞争性，笔者于不同PCR反应管中分别扩增目的基因和内参基因，分别得到其标准曲线，通过曲线的斜率可以计算待测样本相对初始拷贝数，获得的相对定量再通过内参基因进行均一化处理（K值表示）。该方法既简化了绝对定量试验的繁琐过程，又准确可靠的分析不同样本之间目标基因表达的差异[2，6]。为证明标准品的稳定性和克服加样误差，笔者进行了重复性试验，试验中2平行管扩增曲线图，表现了良好的重复性。此外，扩增产物定量的准确性有赖于得到良好的标准曲线，直线拟合度越高，即斜率(slope) 在-2.99和-3.99，相关系数（r）越接近1（r>0.98），可信度越高。实验得到Grb10和Gapdh双标准曲线的相关系数（r）分别达到98.38％和99.87%，有很好的线性关系，故可以在宽广的范围内对目的基因进行准确检测，可以用于mRNA定量分析。
　　
　　本实验采用SYBR GreenⅠ染料法进行mRNA表达相对定量分析，简便又快速地实时监测整个PCR反应过程，同时还可以通过溶解曲线分析以识别扩增产物，排除非特异性扩增。实验中，目的基因Grb10和内参基因可见窄而尖的溶点峰，表明实验中无出现污染、引物二聚体和非特异性扩增，产物纯度高。在PCR结束后通过凝胶电泳成像分析进一步明确了扩增产物的特异性。可见，该反应体系完好，PCR扩增特异性高，可信度高，可用于统计学分析。实验结果显示，鼠尾成纤维样细胞在传代培养过程中印迹基因Grb10 表达水平上调。印迹基因是表观遗传学的重要组分之一，组织培养容易诱导基因表达发生改变，这与生物体在接受各种内在或外在应激时，为更好适应生存环境而发生某些特定基因表达的改变是相类似的[7]。体外培养因脱离体内调节的调节机制，往往导致一些环境变异因素，如激素、生长因子、毒素、饮食性甲基团供给不足等，从而可能发生基因组整体甲基化水平的降低[810]。哺乳动物印迹基因表达水平的改变与表观遗传修饰的改变密切相关。
　　
　　在对胚胎干细胞的体外培养中，Sanjeev等发现，培养液中的血清可以使多个生长相关性的印迹基因的表达发生改变；同样植入前胚胎进行一段时间的体外培养后，发生印迹基因表达脱调节，从而导致胎儿生长和发育的异常改变[11]。母本等位基因表达的Grb10印迹基因编码的衔接蛋白——生长因子10作用于IGF/INS轴，经由Sh3区域与IGF1受体和胰岛素受体结合，阻断细胞内信号传导途径，对细胞增殖起负性调节作用。因鼠尾成纤维样细胞是小鼠克隆的重要供核细胞，作为供核细胞已成功克隆出小鼠[3]，故本实验选择鼠尾成纤维样细胞，对其进行体外传代培养研究，检测到印迹基因Grb10表达水平发生了改变，在一定程度上补充了印迹基因Grb10相关方面的研究；同时为探讨小鼠克隆中基因印迹的表观遗传重编程机制提供实验依据。欲进一步阐释传代培养中发生Grb10表达水平改变的具体机制，下一步将对其相关的表观遗传修饰进行研究。

参考文献

　　[1] 杨晓煜，戴 博. 基因的重新编程与哺乳动物克隆[J]. 中国生物工程杂志， 2003，23(8):1822.

　　[2] 张池宇，徐顺高，黄新祥. 一种新颖简便的实时荧光定量RTPCR相对定量方法的建立[J]. 生物化学与生物物理进展， 2005，32(9):883888.

　　[3] Ogura A，Inoue K，Takano K，et al. Birth of mice after nuclear transfer by electrofusion using tail tip cells[J]. Mol Reprod Dev， 2000，57(1):5559.

　　[4] Giulietti A，Oerbergh L，Valckx D，et al. An overview of realtime quantitative PCR:applications to quantify cytokine gene expression[J]. Methods， 2001，25(4):386401.

　　[5] Liu W，Saint D A. A new quantitative method of realtime reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics[J]. Anal Biochem， 2002，302(1):5259.

　　[6] 张驰宇，成 婧，李全双，等. 荧光实时定量PCR的研究进展[J]. 江苏大学学报(医学版)， 2006，16(3):268271.

　　[7] Tregear J W， Morcillo F， Richaud F， et al. Characterization of a defensin gene expressed in oil palm inflorescences:induction during tissue culture and possible association with epigenetic somaclonal variation events[J]. Cell and Molecular Biology， 2002，53(373):13871396.

　　[8] Wilson A G. Epigenetic regulation of gene expression in the inflammatory response and relevance to common diseases[J]. Periodontol， 2008，79(8):15141519.

　　[9] Anway M D，Cupp A S，Mzumcu M，et al. Epigenetic transgenerational actions of endocrine disruptors and male fertility[J]. Science， 2005，308(5727):14661469.

　　[10] Waterland R A，Lin J R，Smith C A，et al. Postweaning diet affects genomic imprinting at the insulinlike growth factor 2 (Igf2) locus[J]. Hum Mol Genet， 2006，15(5):705716.

　　[11] Sanjeev K，Wendy D，David B，et al. Culture of preimplantation mouse embryos affects fetal development and the expression of imprinted genes[J]. Biology of Riproduction， 2001，64(3):918926