作者：王健生，张明鑫，段小艺，
王峥，周苏娜，张广健，王全颖，杨广笑
【摘要】 目的 构建Apoptin的原核表达载体，并制备抗原物质Apoptin融合蛋白。方法 在获得Apoptin融合基因的基础上，成功构建了Apoptin的高效原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin，将该质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体菌中，以IPTG对其进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果 转化有Apoptin的原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后，经SDS-PAGE分析，在相对分子质量约17 000的位置出现目的蛋白条带，大小与Apoptin融合蛋白一致。结论 Apoptin原核表达载体pET-28a(+)-Apoptin能够表达出Apoptin融合蛋白，为进一步的Apoptin研究和制备Apoptin抗体奠定了基础。
【关键词】 Apoptin 原核表达载体 pET-28a(+) 大肠杆菌
ABSTRACT: Objective To construct an Apoptin prokaryotic vector， aiming to produce antigenic fusion protein Apoptin. Methods The Apoptin gene was amplified from the template of plasmid pSSCHG/NT4-Apoptin- HA2-TAT by PCR. The Apoptin was sub-cloned into the multiple clone sites of plasmid pET-28a (+) to get the prokaryotic vector of pET-28a (+)-Apoptin， which was transformed into E.coli BL21 (DE3). Expression of E.coli BL21 (DE3) was induced by IPTG. The specific protein expression was detected by SDS-PAGE. Results The fusion protein was expressed with high efficiency in E.coli BL21 (DE3) transformed by pET-28a (+)-Apoptin after induction with IPTG. The specific fusion protein had an apparent related molecular weight of about 17 000 ku as indicated by SDA-PAGE analysis. Conclusion The Apoptin prokaryotic expression vector with pET-28a (+)-Apoptin can effectively express Apoptin fusion protein， laying a foundation for further study of Apoptin and preparation of antibodies against Apoptin.
KEY WORDS: Apoptin; prokaryotic expression vector; pET-28a (+); E.coli
目的基因或载体对正常组织的毒性和肿瘤细胞对治疗的耐受等是限制肿瘤基因治疗临床应用的瓶颈。Apoptin(凋亡素)的发现突破了上述瓶颈，给抗肿瘤的基因治疗带来了转机。Apoptin是鸡贫血病毒(chicken anemia virus， CAV)的vp3基因编码的蛋白质，体外合成或基因工程表达的Apoptin能特异的引起多种人源性恶性肿瘤细胞凋亡，对正常二倍体体细胞无作用；且这种选择性凋亡作用既不依赖于p53的介导，也不被bcl-2过表达所抑制［1］，显示其可能在肿瘤基因治疗中具有迷人的应用前景。本实验在获得CAV Apoptin基因的基础上，构建Apoptin的原核表达载体(图1)，为下一步表达特异性蛋白产物、制备Apoptin抗体奠定基础［2］。
1 材料与方法
1.1 质粒、菌株、工具酶及试剂
含Apoptin全基因组序列的体外克隆NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒由本课题组构建［2］；大肠杆菌Top10、大肠杆菌BL21均来自西安华广生物工程公司；质粒pGEM-T Easy购自Promega公司；质粒pET-28a(+)购自Novegen公司；限制性内切酶、Taq聚合酶购自华美生物公司；T4 DNA 连接酶购自MBI公司；主要试剂为国产或进口分析纯。
1.2 引物的设计和合成
根据前期研究的Apoptin基因序列的结果［2］，按照载体上正确的插入方向和译读框架设计一对引物。引物的5′端分别添加了限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切序列。扩增的片段包括Apoptin完整的基因序列。上游引物：5′-GGAATTCATGAACGCTCTCCAAGAAG-3′；下游引物：5′-GCTCGAGTCACAGTCTTATACGCCTTCTTG-3′(下划线处分别为EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切序列)，由上海生工生物工程公司负责合成，用PAGE纯化。
1.3 目的基因的扩增和纯化
以含有Apoptin全基因组序列的pSSCHG/NT4-Apoptin-HA2-TAT为模板，上下游引物各50 pmol，10×PCR反应缓冲液10 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，加超净水至终体积为49 μL。94 ℃预变性5 min、94 ℃变性1 min、50 ℃退火1 min后，再加入1 μL Taq DNA聚合酶。进行94 ℃变性1 min、50 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min 30个循环，72 ℃继续延伸5 min。经酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，70%(体积分数)乙醇洗涤沉淀后用30 μL TE充分溶解沉淀。取少量PCR产物进行10 g/L的琼脂糖凝胶电泳，并在紫外线测定A260值对产物进行定量。
1.4 重组质粒pGEM-T Easy/Apoptin(pT/Apoptin)的构建与鉴定
取上述PCR产物600 ng(0.2 g/L)、质粒pGEM-T Easy 25 ng(50 g/L)、T4DNA连接酶5 u(5 u/μL)、10×T4 DNA连接酶缓冲液2.5 μL以及去离子水18 μL(总体积25 μL)建立连接反应体系，23 ℃水浴1h。取10 μL连接产物转化100 μL感受态大肠杆菌Top10，涂布LB(Amp+)平皿，37 ℃倒置过夜。从LB平皿中挑选单菌落用碱裂解法，经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳，筛选出正确重组质粒进行大量制备。对含有目的基因的重组质粒进行DNA测序(上海生工生物工程公司)。
1.5 重组质粒pET-28a(+)-Apoptin的构建和鉴定
将测序正确的重组质粒pGEM-T Easy/Apoptin、pET-28a(+)分别进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，各取1 μL酶切产物、1 μLT4DNA连接酶、10×T4DNA连接酶缓冲液2.5 μL、去离子水18.5 μL(总体积25 μL)，16 ℃水浴过夜。取10 μL连接产物转化100 μL感受态大肠杆菌Top10，涂布LB(Kan+)平皿，37 ℃倒置过夜。从LB平皿中挑选单菌落用碱裂解法，经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳，筛选出正确重组质粒进行大量制备。
1.6 重组质粒pET-28a(+)-Apoptin在大肠杆菌中的表达
用重组质粒pET-28a(+)-Apoptin转化E.coli BL21 (DE3)受体菌，同时用质粒pET28a(+)转化BL21菌作对照。分别挑取单个阳性菌落接种入5 mL LB培养液中，37 ℃振摇培养至培养液的A600达0.4-0.6。各取2 mL培养菌液加入200 mL Kan+的LB培养液中，振摇培养3 h，然后加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续振摇培养8 h，诱导蛋白表达。
1.7 原核表达蛋白的分离和纯化
收集细菌用裂解缓冲液和超声细胞粉碎机裂解细菌，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色，观察蛋白表达。
2 结果
2.1 重组质粒pGEM-T Easy/Apoptin的鉴定
经PCR扩增提取的Apoptin片段与载体pGEM-T Easy连接产生的重组质粒用EcoRⅠ酶切被线性化，10 g/L琼脂糖电泳可得到3 015 bp和363 bp的两个片段，后者与Apoptin基因片段全长大小一致(图2)。
2.2 重组质粒pGEM-T Easy/Apoptin中的Apoptin基因测序
以pGEM-T Easy通用引物对获得的重组质粒进行DNA序列测定，结果表明插入的Apoptin片段与设计的EcoRⅠ-Apoptin-XhoⅠ片段序列完全一致，无碱基突变和读码框移位。同GenBank的Apoptin 基因序列AY171617一致。
2.3 重组质粒pET-28a(+)-Apoptin的鉴定
经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒pGEM-T Easy/Apoptin与载体pET-28a(+)连接产生的重组质粒pET-28a(+) -Apoptin，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切被线性化，10 g/L琼脂糖电泳可得到5 368 bp和363 bp的两个片段，后者与Apoptin基因片段全长大小一致。
2.4 Apoptin在大肠杆菌中的表达
pET-28a(+)-Apoptin转化菌和阳性重组菌同步培养裂解后，经SDS-PAGE电泳并染色发现，重组质粒诱导表达后表达产物主要以包涵体的形式存在于沉淀中，在相对分子质量(Mr)为17 000处可见目的条带，因融合蛋白含有His标签、T7标签和凝血酶蛋白酶切位点，故表达蛋白的相对分子量与预期一致(图3)。
3 讨论
CAV能诱导雏鸡造血母细胞和C淋巴细胞前体细胞凋亡，并导致雏鸡出现严重的贫血及免疫机能低下。1994年Noteborn等发现了VP3蛋白是CAV的凋亡功能蛋白。1995年Zhuang等发现VP3能以不依赖p53的途径诱导人骨肉瘤细胞凋亡，因此将这种小分子病毒蛋白命名为Apoptin(凋亡素)。进一步研究表明，Apoptin能特异性诱导人转化细胞和肿瘤细胞凋亡，但对正常的人二倍体细胞无凋亡诱导作用，被认为是第一个真正意义上可选择性诱导肿瘤细胞凋亡而不损伤正常细胞的凋亡蛋白。
越来越多的研究证明，应用Apoptin治疗肿瘤是理想的靶向性治疗方式。Guelen等［3］将蛋白转导结构域—TAT基因融合于Apoptin基因后明显提高转染效率，并且仍能表现出选择性凋亡能力。Lian等［4］则尝试运用白介素18(IL-18)增强Apoptin的抗肿瘤作用。Peng等［5］将去唾液酸糖蛋白与Apoptin联接，借由肝细胞特异的唾液酸蛋白受体而实现体内外靶向治疗肝癌。因此，重组表达和纯化有生物活性的Apoptin对于继续研究肿瘤细胞特异的凋亡机制、建立肿瘤细胞特异性治疗方法具有重要意义。
Novagen公司的pET表达体系是目前在原核细胞中克隆和表达融合蛋白的最佳体系之一，也是现今原核表达方面使用最广泛的系统。本实验选用pET-28a(+)作为表达体系有下述优点：①含T7lac启动子，可高效及严谨地控制表达水平；②N端含有His·Tag/T7·Tag融合标签，很方便用Western blot检测，可利用His·Tag进行金属离子螯合层析纯化表达蛋白，也可利用T7·Tag融合标签进行基于抗体结合的亲和纯化；③含凝血酶(thrombin)蛋白酶切位点体，可以在纯化完成后切去上述融合标签。因此，表达出的融合蛋白在多种情况下都可以便利地和经济地进行纯化。纯化后的蛋白一方面可以进行Apoptin基础和临床的相关研究，另一方面可以作为优良的抗原，通过动物免疫可以获得Apoptin的多克隆或单克隆抗体，有助于Apoptin作用机制的研究。
本研究成功扩增出高度保真的Apoptin基因，测序鉴定与GenBank的AY171617的原始序列一致；并通过亚克隆构建了Apoptin的高效原核表达载体pET-28a(+) -Apoptin，经IPTG能高效表达出含有His标签、T7标签和凝血酶蛋白酶切位点的Apoptin融合蛋白，且主要以包涵体的形式存在于沉淀中，相对分子质量约17 000，大小与预期的Apoptin融合蛋白一致。获得的Apoptin蛋白可用于进行Apoptin体外基础和应用研究，并为制备抗Apoptin抗体奠定基础。
参考文献
［1］Danen-Van Oorschot AA， Zhang Y， Erkeland SJ， et al. The effect of Bcl-2 on Apoptin in normal vs transformed human cells ［J］. Leukemia， 1999， 13(Suppl 1):S75-77.
［2］刘德纯，王健生，王作人，等. 鸡贫血病毒Apoptin蛋白编码基因的克隆和序列分析 ［J］. 第四军医大学学报， 2007， 28 (11):961-963.
［3］Guelen L， Paterson H， Gken J， et al. TAT-apoptin is efficiently delivered and induces apoptosis in cancer cells ［J］. Oncogene， 2004， 23(5):1153-1165.
［4］Lian H， Jin N， Li X， et al. Induction of an effective anti-tumor immune response and tumor regression by combined administration of IL-18 and Apoptin ［J］. Cancer Immunol Immunother， 2007， 56(2):181-192.
［5］Peng DJ， Sun J， Wang YZ， et al. Inhibition of hepatocarcinoma by systemic delivery of Apoptin gene via the hepatic asialoglycoprotein receptor ［J］. Cancer Gene Ther， 2007， 14(1):66-73.