【摘要】 目的 探讨TNFα、NF-κB、Leptin-Rb和PPAR-γ等在大鼠酒精性肝病中与肝组织炎症、坏死和纤维化的关系。方法 胃造瘘法建立长期大鼠酒精性肝病模型，分别在第4、8、12、24和52周用免疫组化、原位杂交和RT-PCR技术检测不同阶段大鼠肝组织中TNFα、NF-κB、PPAR-γ和Leptin-Rb等的表达。结果 TNFα、NF-κB和Leptin-Rb水平在模型组大鼠肝细胞中，第8周表达逐渐增强，第24周起高水平表达一直持续至52周(P<0.01)。PPAR-γ在对照组和第4、8周模型组肝细胞中表达最强，第12周表达开始减弱。TNFα和NF-κB在肝细胞中的表达呈明显正相关关系，与PPAR-γ则呈负相关关系(P<0.01)。结论 TNFα和NF-κB与肝细胞病变程度有很好的一致性关系，Leptin-Rb在肝细胞的表达与肝纤维化发展相一致，PPAR-γ则刚好相反。
【关键词】 酒精性肝病 细胞因子 大鼠
ABSTRACT: Objective To investigate the expressions of TNFα， NF-κB， leptin-Rb and PPAR-γ mRNA in liver tissues of rats with alcoholic fatty liver to identify the relationship between these factors and liver inflammation， necrosis and fibrosis. Methods Long-time rat model groups (gastric cannulation ethanol infusion models of ALD) were made. At the end of 4th， 8th， 12th， 24th and 52th week， the expressions of TNFα， NF-κB and PPAR-γ protein and mRNA in rat liver tissues were observed with immunohistochemical method and in situ hybridization. Reverse transcription polymerase chain reaction was performed to determine the expression of Leptin-Rb mRNA. Results The expressions of TNFα， NF-κB and leptin-Rb in rat alcoholic fatty liver enhanced gradually from week 8. Strong positive expression lasted from week 24 to week 52. The expression of PPAR-γ was strongly positive in control group and in 4th and 8th week model groups (P<0.01). The expression weakened from week 12. The expression of TNFα in liver tissues was positively correlated with that of NF-κB significantly and negatively correlated with that of PPAR-γ. Conclusion TNFα and NF-κB were strongly positively correlated with the liver inflammation and necrosis. The expression of leptin-Rb increased in hepatocytes， which induced hepatic fibrosis in rats. The expression of PPAR-γ increased in the initial period and lowered in the later time.
KEY WORDS: alcoholic fatty liver; cytokine; rats
肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNFα)是一种早期反应的细胞因子，在损伤初期即开始诱导其他促炎及抗炎递质的表达增加或减少，使体内炎症反应失衡。核转录因子(nuclear factor κappa B， NF-κB)是TNFα炎症级联反应中的重要启动因子，在肝脂肪变和纤维化的发生发展中起着重要作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ， PPAR-γ)参与多种炎性介质合成及分泌的调节，特别是在脂肪细胞分化、糖脂代谢调节和胰岛素抵抗中起重要作用。瘦素(leptin)参与肝脏糖及脂肪的代谢调节，使甘油三酯合成增加，肝糖原产生减少［1］。但是，目前对它们在酒精性肝病发病过程中的作用还不明确，有待做大量的研究工作才能得到验证。国内在这方面的研究还很少。本实验拟对TNFα、NF-κB、Leptin-Rb和PPAR-γ等在大鼠酒精性肝病不同阶段肝组织中的表达进行检测，研究它们之间的相互关系及其在肝组织脂肪变、炎症坏死和肝纤维化的发生、发展过程中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验仪器与试剂
梯度PCR仪 9700(美国Gene Amp公司)，自动凝胶扫描成像分析系统(美国 Wealtec公司)，紫外可见分光光度仪(美国Amersham Biosciences公司)；大鼠TNFα mRNA原位杂交试剂盒，大鼠NF-κB P65 mRNA原位杂交试剂盒，兔抗大鼠PPAR-γ多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，RT-PCR一步法试剂盒(TaKaRa 宝生物工程有限公司)，总RNA提取试剂盒(清华天为时代生物工程有限公司)，PCR引物(上海生工生物技术有限公司)。鲎试剂偶氮显色法测定内毒素(上海市临床检验中心试剂盒)。
1.2 实验方法
普通清洁级健康雄性成年SD大鼠80只，体重150-200 g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。饲养于西安兵器工业521医院卫生研究所实验动物中心。动物房通风良好，温度保持在20-27 ℃。经胃造瘘管灌酒制作酒精肝实验动物模型，并设实验对照组，具体方法同文献报道［2］。造模成功后分别于第4、8、12、24周及52周，在各实验组和对照组中随机取8只大鼠，硫喷妥钠30 mg/kg体重腹腔注射麻醉，心包腔无菌穿刺采血处死，常规分离血清，测肝功、甘油三酯(triglyceride， TG)和总胆固醇(total cholesterol， TCh)及血糖(blood glucose， GLU)。另取1 mL血置于肝素化去致热原试管中，分离血清送第四军医大学临床检验中心测定内毒素含量。取肝组织制成石蜡切片常规HE染色，肝组织病理学观察。同时用免疫组化和原位杂交试剂盒分别检测肝组织中PPAR-γ，TNFα mRNA和NF-κB P65 mRNA，方法按试剂盒使用说明书稍加改进。肝组织中Leptin-Rb的检测用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)一步法，常规抽提肝组织RNA后，按试剂盒使用说明书配制RT-PCR反应液总量50 μL，按以下条件进行RT-PCR反应：94 ℃变性，30 s；60 ℃退火，30 s；72 ℃延伸，60 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min，扩增产物电泳检测。引物按
参考文献
报道合成［3］。1.3 统计学处理
数据的统计学分析采用SPSS10.0统计分析软件。计量资料的统计描述采用均数±标准差。组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清内毒素水平的变化
酒精肝模型组大鼠在实验的第4周起血清内毒素水平开始高于实验对照组大鼠，有显著性差异(P<0.05)。模型组大鼠血清内毒素水平逐渐升高，至24周达高峰，且一直维持在高水平至实验结束。对照组大鼠则始终无明显升高，从实验的第8周起，与模型组相比较，有非常显著性差异(P<0.01，表1)。表1 两组大鼠血清内毒素水平的比较（略）
2.2 肝脏病理学的改变
光镜下，正常组与实验对照组大鼠肝脏无异常病变。4周时，模型组大鼠，部分肝细胞胞质内有微小脂滴，小叶内可见少量炎细胞浸润；8周时可见肝细胞空泡样变性，胞质内有较多微小脂滴，核固缩，肝窦受压，肝索排列紊乱，肝细胞有点状及灶状坏死。可见Kupffer细胞增生；12周时上述病变加重，肝细胞胞质内挤满了典型的微小脂滴，点状及灶状坏死较多见；汇管区有较多炎性细胞浸润，明显的窦周纤维化；24周时，纤维化更加明显，甚至可见小叶内纤维分隔和静脉周围纤维化；52周时纤维化进一步发展，可见小叶内纤维分隔增多，但未见假小叶形成，炎症坏死和脂肪变减轻。酒精肝模型组大鼠部分肝细胞内尚可见大泡性脂变，且以肝细胞3区和2区为重，约30%肝细胞胞质内可见到Mallory小体，汇管区炎性细胞浸润较明显，以单核细胞、淋巴细胞为主。详见文献报道［2］。
2.3 血清生化指标的变化
实验各时段，模型组大鼠血清肝功丙氨酰氨基转移酶(alanine aminotransferase， ALT)、天门冬酰氨基转移酶(aspartate aminotransferase， AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)较对照组显著升高，尤以AST和ALP升高为著(P<0.01)。模型组大鼠血清白蛋白(albumin， ALB)在24周后明显下降，与对照组相比有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。模型组大鼠血清总胆固醇(total cholesterol， TCH)、血糖(blood glucose， GLU)水平与对照组相比无显著性差异(表2)。表2 两组大鼠不同阶段血清肝功能的变化（略）
2.4 TNFα、NF-κB和PPAR-γ在模型组大鼠肝细胞中的表达
TNFα和NF-κB在酒精肝模型组大鼠肝细胞中，从第4周起就开始有较弱表达，与对照组相比已有显著性差异(P<0.05)。从第8周起，模型组表达逐渐增强，至24周时呈强阳性表达，一直持续至52周实验结束时。对照组则几乎无明显表达(P<0.01)。PPAR-γ在对照组和第4周、第8周模型组大鼠肝组织炎症状态的肝细胞中表达最强，从第12周在模型组中的表达开始减弱，至大鼠肝组织炎症、纤维化形成后24周时呈弱阳性，直至实验结束(图1)。与对照组相比差异显著(表3)。从第8周起模型组肝组织中可检测到Leptin-Rb水平的升高，对照组仅可检测到低水平的Leptin-Rb，但两组间比较无差异。此后，酒精肝模型组Leptin-Rb水平逐渐升高，至24周、52周时升至最高。与对照组相比差异显著(P<0.01，图2)。
2.5 TNFα、NF-κB、Leptin-Rb和PPAR-γ在大鼠肝细胞中表达的相互关系
从本实验可明显看出，TNFα和NF-κB呈明显正相关关系，相关系数r=0.98，P<0.01。TNFα和PPAR-γ在大鼠脂肪性肝病肝细胞中的表达呈负相关关系，相关系数r=-0.74，P<0.05。在大鼠脂肪肝形成之初， PPAR-γ呈高水平表达；而随着脂肪肝病变的进展，TNFα、NF-κB表达增强，PPAR-γ的表达则逐渐减弱，两方面均在24周时达到平衡。Leptin-Rb水平升高稍晚，但进行性发展，随病变进展而逐渐升高，至晚期达高峰。表3 两组大鼠不同阶段肝细胞中细胞因子的表达（略）
2.6 TNFα、NF-κB、Leptin-Rb和PPAR-γ与内毒素血症和肝组织病变的关系
TNFα和NF-κB与内毒素血症有很好的正相关关系，血清内毒素水平越高，TNFα和NF-κB表达越强，相关系数r=0.98，P<0.01。PPAR-γ表达呈现先强后弱的过程，与内毒素血症无明显相关关系。TNFα和NF-κB与肝细胞病变发展相一致，在肝损伤之初，TNFα和NF-κB表达较弱，随着TNFα、NF-κB表达增强，肝损伤逐渐加重，炎症坏死较明显，血清酶学水平升高。到后期，虽然TNFα、NF-κB表达再无明显增强，但肝细胞损伤继续进展。Leptin-Rb在脂肪肝损伤较重时才开始升高，至肝纤维化阶段达高峰，与肝纤维化发展相一致，与血脂水平相一致。PPAR-γ与肝组织病变的关系同TNFα和NF-κB也刚好相反。肝损伤初期，PPAR-γ表达较强；肝损伤中后期，损伤程度逐渐加重，PPAR-γ表达逐渐减弱；在肝损伤过程中，PPAR-γ表达呈先强后弱的趋势。
3 讨论
酒精性肝病与非酒精性脂肪肝同样，在发病机制上也有许多学说［4-7］。“二次打击”学说是近年来提出的关于酒精性和非酒精性脂肪性肝炎发病的重要假说［8-9］。目前公认，肠源性内毒素血症在急性肝功能衰竭的发病中起着重要的作用。而长期饮用酒精所引起的空肠G-杆菌生长、肠黏膜屏障损伤以及继发的肠源性内毒素血症，可以激活肝脏Kupffer细胞，释放各种炎症介质，引起肝脏炎症坏死和纤维化，在酒精性肝炎的发生中起重要作用。内毒素，无论体内或体外，均可引起肝细胞损伤、坏死［10-11］。内毒素可与乙醇共同作用活化Kupffer细胞等单核巨噬细胞，最主要通过TNFα介导，释放包括TNFα等细胞因子在内的各种炎症介质，损伤肝脏并可能影响肝脏天然免疫系统［12］。
本研究中TNFα mRNA表达增加在酒精性脂肪肝时最早出现，在造模12-24周时大鼠脂肪性肝炎向严重阶段发展并一直维持高表达状态。此阶段肝细胞损伤也逐渐加重。TNFα mRNA在肝细胞表达增强是与血清内毒素水平升高及肝细胞脂肪变和炎症坏死程度相一致的。说明TNFα和内毒素水平这两者在酒精性肝病的发生中起了始动因子的作用。这与众多学者强调其在脂肪肝特别是酒精性肝病发病中的重要性的观点一致。对照组大鼠血清内毒素水平较低，其肝组织中也没有TNFα mRNA表达。
Yang等［13］给ob/ob小鼠或fa/fa大鼠腹腔内注射小剂量内毒素，使模型动物致死率明显增高，存活的动物则表现为严重的脂肪性肝炎。胰岛素抵抗状态下的白色脂肪组织能释放多种细胞因子，如TNFα、IL-6等。这些细胞因子尤其是TNFα对巨噬细胞分泌其他炎症因子等功能有调节作用。本研究中模型组大鼠内毒素血症水平升高，TNFα mRNA有高表达，导致了脂肪肝和脂肪性肝炎的形成。
已知NF-κB具有2个亚单位，即P50和P65。NF-κB激活后进入核内，启动基因的表达。当各种原因导致肝脏内的脂质沉积增多时，这些脂质本身也可作为“促炎因子”，不同程度的诱导Kupffer细胞的活化，增加其对内毒素的敏感性，因而在脂肪肝发生的早期，甚至单纯性脂肪肝阶段，就存在Kupffer细胞活化，释放足以造成肝脏损伤的TNFα、NF-κB等炎症介质，从而引起脂肪性肝炎。因此，饮酒、肥胖等状态下，内毒素血症、血清和肝脏等组织内增多的脂质可能影响巨噬细胞的表型，首先释放TNFα，进而促使NF-κB等更多的炎症介质释放［14］。
在肝纤维化中，体内活化的肝星状细胞可以分泌瘦素(leptin)，推测 Leptin对肝脏炎症及纤维化起促进作用。但也有不同的报道，认为血清 Leptin能预测肝脂肪变性的严重程度，但不能预测肝脏炎症或纤维化的严重程度。Leptin 可以使巨噬细胞受内毒素刺激后生成TNFα、IL-6、IL-12等细胞因子增多［15］，促进肝细胞变性坏死。有研究发现脂肪肝患者血浆瘦素水平明显高于对照组，且经多元回归分析表明瘦素是脂肪肝发生的独立危险因素。肝硬化患者血清Leptin 水平也显著高于正常对照组，且其水平随着纤维化进程而增加，提示Leptin可能对调节肝纤维化起一定的作用。推测瘦素作为肝纤维化进展的危险因子，刺激肝窦内皮细胞产生TGF-β，诱导肝星状细胞活化，促进肝纤维化的形成［16］。瘦素必须与其受体结合才能发挥生物学效应。因此，测定瘦素受体在肝细胞中的表达，就可间接反映瘦素水平。
我们的研究发现，瘦素受体不仅在肝脂肪变阶段就开始上升，而且在纤维化阶段上升更加明显，与TNFα、NF-κB的表达和肝脂肪变有一定关系，但似乎与肝纤维化的关系更密切。间接说明Leptin促进了肝纤维化的发生、发展。
PPAR-γ的适量表达在脂肪细胞分化中起重要作用，其活化后能使转运至肌肉和肝脏的脂肪酸减少，脂肪合成降低，从而改善胰岛素抵抗，抑制脂代谢［17］。过度表达则产生严重的脂代谢紊乱。有研究发现，脂肪细胞产生的TNFα通过下调PPAR-γ的表达，抑制其自身分化。PPAR-γ不仅与脂肪代谢和胰岛素抵抗相关，而且与炎症反应有关［18］，在小鼠，单核/巨噬细胞活化后PPAR-γ表达升高，从而抑制细胞对多种炎性刺激的反应。这说明PPAR-γ有抗炎作用。这与我们的结果一致。在正常肝细胞有一定量的PPAR-γ表达，在肝脂肪变明显及脂肪性肝炎形成时，TNFα、NF-κB尚未大量产生，PPAR-γ的表达较强，特别是在炎症坏死的始动区域小叶中心区表达最强。但随着TNFα、NF-κB的表达不断增强，肝细胞炎症反应不断增加，PPAR-γ的表达即开始减弱，似乎受到了某种抑制。据此推测PPAR-γ在炎症早期升高，可能具有一定的抗炎作用，但因酒精、高脂等炎症诱发因素持续存在，TNFα、NF-κB的表达不断增强，PPAR-γ的表达被抑制，使TNF介导的肝细胞保护因子和有害因子产生失衡，使细胞因子反应向前炎症轴方向移动，肝脏病变得以不断发展，再在Leptin等细胞因子持续作用下，将诱发过强细胞脂质过氧化作用，加重脂肪肝，最终导致肝纤维化的大量产生。
因此，在酒精所致脂肪肝的形成过程中，内毒素血症诱发了前炎症因子TNFα、NF-κB的产生，抑制了PPAR-γ的表达，随后的脂质过氧化反应又促使Leptin在肝细胞进一步表达，最终导致肝纤维化的形成。
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