作者：马列婷，王亚文，杨朵，袁育康
【摘要】 目的 比较捕捉法和间接法检测IgM时的特异性和敏感度差异，并探讨其产生差异的原因。方法 分别用间接ELISA法和捕捉ELISA法检测活动性乙型肝炎和肾综合征出血热(HFRS)患者标本的IgM水平，并比较两者之间检出率、检测阈值、特异性的差异。结果 检测稀释在PBS中的鼠抗IgM特异性抗体，两种方法的特异性和敏感度类似；检测活动性乙型肝炎和HFRS患者标本，间接法检测IgM的敏感度明显低于捕捉法；检测经二巯基乙醇处理后乙肝组和HFRS组标本，两种检测均为阴性，表明两种方法都具有针对IgM抗体的型特异性；交叉实验结果证明两种检测IgM的试剂均具有针对抗原的特异性。结论 急性感染疾病的早期诊断、病毒的潜伏期感染和慢性感染的再次激活应使用捕捉法检测IgM，间接法检测IgM用于急性感染性疾病的诊断有待进一步探讨。
【关键词】 乙型病毒性肝炎 肾综合征出血热 间接ELISA 捕捉ELISA IgM
ABSTRACT: Objective To assess the differences in the specificity and the sensitivity in detecting specific IgM by indirect ELISA and capturing-ELISA methods， and to analyze the possible causes of those differences. Methods The HBc-IgM and EHF-IgM level in serum samples from activity Hepatitis B patients and hemorrhagic fever patients with renal syndrome were determined by both indirect-ELISA and capturing-ELISA methods， and the differences in the positive rate， positive threshold value and the specificity between those two methods were compared. Results Specific murine IgM diluted in PBS were detected by indirect-ELISA and capturing-ELISA， and the specificity and sensitivity of those two methods were similar. Results showed that sensitivity of indirect-ELISA was lower than capturing-ELISA in detecting specific IgM in serum from patients with activity Hepatitis B and hemorrhagic fever patients with renal syndrome. The IgM level in hepatitis B and hemorrhagic group treated with thioglycol became negative detected by those two methods， suggesting that both of them have the anti-IgM epitope-specificity. Cross reaction results demonstrated that the reagent detecting IgM from the two methods had the specificity to the specific antigen. Conclusion It is recommended to detect IgM level by capturing-ELISA method for the early diagnosis of acute infectious disease， pathological changes， immune reaction and prognoses of chronic continuous infectious disease. Applying the indirect-ELISA method to detect IgM level to diagnose acute infectious disease is to discuss in the future.
KEY WORDS: viral hepatitis B; hemorrhagic fever with renal syndrome; indirect ELISA; capturing-ELISA; immunoglobulin M
检测病毒IgM抗体主要用于对病毒感染性疾病的早期诊断。多数肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome， HFRS)患者发病初期可能有特异性IgM抗体［1］。间接法和捕捉法检测IgM的特异性和敏感度是否存在差异，及产生差异的原因尚未见系统的研究报告。本研究通过比较捕捉法和间接法检测IgM时的特异性和敏感度的差异，分析其影响因素，从而探讨两种方法产生差异的原因。
1 材料与方法
1.1 研究对象
①HFRS患者血清：30例，男22例，女8例，年龄6-70岁。标本由陕西省疾病预防控制中心病毒一室提供。标本采集时间为发病后3-20 d。其中发病后1周内23例，1周后7例。②乙型肝炎病毒感染患者血清：男34例，女23例，年龄15-74岁。标本选自西安交通大学医学院第一附属医院2007年1月-5月住院患者，依据1990年上海全国第六次病毒性肝炎会议标准(实用传染病手册)诊断为慢性活动性乙型肝炎。③正常对照血清：20例，其中男12例，女8例，年龄21-67岁。标本选自陕西省疾病预防控制中心提供的健康体检者，否认肝病和HFRS病史，无乙肝疫苗和HFRS疫苗接种史，乙肝免疫标志物5项检测均阴性，肝功能正常。以上两种疾病患者和健康体检者经肘静脉采血，分离血清后置-20 ℃冰箱保存。
1.2 主要试剂
汉坦病毒S基因原核表达蛋白、基因工程HBcAg、基因工程HbeAg(西安华广公司)；小鼠抗人μ链单克隆抗体(中国医学科学院基础所免疫研究室)；羊抗小鼠μ链多克隆抗体和抗小鼠IgG单克隆抗体(Sigma公司)；小鼠抗人IgG单克隆抗体、小鼠抗HBc IgG型和IgM型单克隆抗体、小鼠抗Hantaan病毒S抗原的IgG型和IgM型单克隆抗体(西安华广公司)；辣根过氧化酶RZ>3.0(Sigma 公司)；TMB(德国波明翰公司)。
1.3 方法
1.3.1 间接法和捕捉法检测小鼠抗HBc-IgM，抗Hantaan-S-IgM
将纯化的小鼠抗-HBc IgM单克隆抗体、小鼠抗Hantaan-S IgM型单克隆抗体直接稀释到PBS缓冲液中，用间接法和捕捉法ELISA检测IgM敏感性差异，用交叉实验和二巯基乙醇还原实验检测特异性。
1.3.2 间接法和捕捉法检测HFRS和HBc特异性IgM抗体
采用两种方法的试剂盒对临床确诊为HFRS和乙型肝炎感染的患者进行特异性IgM抗体的检测，证实两种方法在检测患者血清特异性IgM时的灵敏度和特异性，并分析是否存在差异。
1.4 统计学处理
采用SPSS统计软件进行统计学处理。计量资料两样本比较采用t检验，计数资料两样本比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两种ELISA方法检测IgM的敏感性比较
2.1.1 对稀释在PBS缓冲液中IgM抗体的检测
采用捕捉法和间接法检测稀释在PBS缓冲液中的小鼠2B3细胞株产生的IgM型抗-Hantaan-S单克隆抗体，其敏感性可以达到0.1 μg/L，间接法和捕捉法不同浓度检测结果与0浓度相比均有显著性差异(表1)。同样采用两种方法检测稀释在PBS缓冲液中的小鼠2E4细胞株产生的IgM型抗-HBc单克隆抗体的敏感性时，其敏感性均大于0.1 μg/L，间接法和捕捉法不同浓度检测结果与0浓度相比均有显著性差异(表2)。实验对照采用相互对照，即检测抗-Hantaan-S单克隆抗体时用小鼠2E4细胞株产生的IgM型抗-HBc单克隆抗体为对照；反之，检测抗-HBc单克隆抗体时用小鼠2B3细胞株产生的IgM型抗-Hantaan-S单克隆抗体为对照。表1 测定小鼠2B3抗Hantaan-S 1.3 IgM型单克隆抗体（略）表2 测定小鼠2E4抗-HBc IgM型单克隆抗体（略）
2.1.2 HFRS和HBV感染血清IgM的检测
用间接法和捕获法检测30例HFRS患者血清的Hantaan-IgM和57例HBV感染患者血清HBc-IgM，间接法检测HFRS患者Hantaan-IgG，将患者按乙肝5项标志物结果的不同分为3组，分别为：HBs-Ag、HBe-Ag、HBc-Ab阳性，用135表示；HBs-Ag、HBe-Ab、HBc-Ab阳性，用145表示；HBs-Ag、HBc-Ab阳性，用15表示。结果显示，无论是急性病毒感染性疾病，还是慢性病毒持续性感染性疾病，间接法检测IgM抗体的检出率都明显低于捕捉法(26/30 vs.15/30，39/57 vs.13/57，P均<0.05)。这提示血清中的抗原或抗体干扰或抑制了间接法测定IgM，但很少或不干扰捕捉法测定IgM(表3、表4)。表3 捕捉法和间接法检测肾病性流行性出血热患者血清抗Hantaan-S-IgM抗体的结果（略）表4 捕捉法和间接法检测乙型肝炎患者血清HBc-IgM抗体的结果（略）
2.2 两种方法检测IgM的特异性鉴定
2.2.1 针对IgM抗体特异性检测
二巯基乙醇处理前、后采用两种方法检测IgM抗体的抑制情况。二巯基乙醇处理后乙肝组和HFRS组标本，用间接和捕捉法检测均转为阴性，表明两种方法都具有针对IgM抗体的型特异性(表5)。表5 二巯基乙醇还原实验结果（略）
2.2.2 针对抗原的特异性检测
两种检测IgM方法针对抗原的特异性是通过交叉实验来鉴定的，也就是使用检测乙肝HBc-IgM的试剂检测抗Hantaan-S-IgM型抗体。使用检测Hantaan-S-IgM的试剂检测抗HBc-IgM型抗体。具体的说，间接法检测抗Hantaan-S-IgM抗体使用HBcAg包被板，捕捉法检测抗Hantaan-S-IgM抗体时使用HBcAg作为捕捉法实验的中和抗原，反之乙肝HBc-IgM抗体用Hantaan-S抗原检测。结果证明两种检测IgM的试剂均具有针对抗原的特异性(表6、表7)。表6 使用乙肝试剂测定小鼠抗-Hantaan-S-IgM型抗体（略）表7 使用检测Hantaan-S-IgM试剂测定小鼠抗-HBc IgM型抗体（略）
3 讨 论
血清特异IgM抗体的酶联免疫检测方法分为捕捉法和间接法［2］。间接法检测IgM是先让包被在固相上的抗原与标本中的IgM结合，再用标记的抗人μ链抗体检测IgM，它先确定被检抗体针对抗原的特异性，即先用已知抗原与样品中的特异性抗体结合，然后再来鉴定抗体是IgM型特异性。捕捉法检测IgM是先确定抗体是IgM型特异性，然后再来鉴定被检抗体针对抗原的特异性。两种方法的免疫学原理没有根本的差异［3］。将IgM型小鼠单克隆抗体，直接稀释到PBS中使用捕捉法和间接法检测，结果表明两者均有良好的特异性，也具有类似的敏感性。但使用捕捉法和间接法同时检测一组急性病毒性疾病(HFRS)和一组慢性病毒性持续感染性疾病(慢性活动性乙型肝炎)的临床标本时，则发现这两种方法具有明显的差异。间接法对慢性活动性乙型肝炎IgM抗体的检出率显著低于捕捉法。两种方法检测IgM的特异性鉴定采用经二巯基乙醇处理两种疾病的标本，分别使用两种方法检测IgM抗体的抑制情况。二巯基乙醇处理后的乙肝组和HFRS标本用间接和捕捉法均转阴，表明两种方法都具有针对IgM抗体的型特异性。两种方法检测IgM针对抗原的特异性是通过交叉实验来鉴定的，结果证明两种检测IgM的试剂均具有针对抗原的特异性。
我们分析产生敏感性差异的原因可能如下：检测血清标本时，间接法检测IgM敏感性较低［4-5］，可能是被检标本之中存在某些抑制间接法检测IgM的成份，而且这些成份很少或并不抑制捕捉法检测IgM。标本中特异性IgG抗体的滴度是否与间接IgM有竞争抑制作用，标本中的同源抗原存在是否在间接法检测IgM测定中具有中和抑制作用，这些都有待于进一步实验证实。
本研究结果提示，在临床使用酶免疫诊断试剂时，尤其是对血清标本的检测应慎重选择检测方法。血清标本存在着复杂的免疫反应成分，包括抗原、抗体和复合物。基于免疫学原理设计的检测试剂，因受到标本中相关抗原和抗体的干扰，影响了结果。因此使用间接法还是选择捕捉法检测标本中的IgM，尚需要进一步研究阐明［6-7］。免疫学诊断试剂的研究，生产和应用都要充分考虑被检标本的复杂性［8-9］，力求通过更合理的实验程序来避免和尽可能的减少标本中免疫活性成分对实验结果的干扰，使我们的检验结果更真实可靠。
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