兔眼环孢霉素A缓释微球的眼内释药性研究

摘要】 　　目的 建立兔眼房水中环孢霉素A缓释微球的高效液相测定方法，考察在不同给药剂量下兔眼房水中的药物代谢特性，为该药预防后发性白内障提供理论依据。方法 兔眼行晶体囊外摘除，左眼前房及囊袋内注射环孢素微球，右眼给予空白微球作对照，采用高效液相色谱法监测给药后4周内兔眼房水中环孢霉素A的浓度。色谱柱为反相C18硅胶柱，柱温为60℃，流动相为乙腈水(67∶33)，检测波长210nm。结果 兔眼房水中环孢霉素A的浓度在0.13-1.25mg/L范围内呈良好线性关系(r=0.9951)，最低检测浓度0.13mg/L，回收率95.91%，日间和日内精密度均小于5.0%。缓释微球的释药速率适中，兔眼前房给药后可在2周内维持较高浓度，高低两种给药剂量下，环孢霉素A的吸收半衰期(t1/2Ka)和血浆清除速率(CL)经检验无统计学差异，药时曲线下面积(AUC)和峰浓度(Cmax)与剂量之间线性相关。结论 环孢素A缓释微球在兔眼内有较高的生物利用度，实验期内可达到抑制后发性白内障的有效浓度。

【关键词】 环孢霉素A；缓释微球；房水；药动学

　　ABSTRACT: Objective To study the pharmacokinetic characters of cyclosporin A(CsA) in aqueous humor in rabbit after implanting different dosages of CsA in eyes and to provide a theoretical basis for the treatment of after cataract. Methods ECCE was performed in all rabbit eyes. CsAMS was injected into the anterior chamber and the capsular bag in left eyes as expression group and MS was given in the same way in right eyes as control group. The concentration of CsA in the aqueous humor was monitored with highperformance liquid chromatogram. The followup period was 4 weeks. The samples were separated on a C18 column at 60℃ and detected at 210nm. The mobile phase was acetonitrilewater (67∶33). Results The correlation analysis showed a positive correlation within the range of 0.13-1.25mg/L (r=0.9951) and the detection limit was 0.13mg/L. The accuracy was 95.91% and the interday and introday precision was less than 5%. CsA in aqueous humor sustained a high concentration within 2 weeks. There were no significant differences in t1/2Ka and CL between the two dosage groups. AUC and Cmax increased in a dosedependent manner. Conclusion The sustainreleased CsA ophthalmic gels provided significant ocular bioavailability in rabbit eyes and they can reach the therapeutic dose in order to inhibit after cataract.

　　KEY WORDS: cyclosporin A; sustained release microsphere; aqueous humor; pharmacokinetic

　　环孢霉素A(cyclosporin A， CsA)是一种常用免疫抑制剂，在眼科主要用于治疗角膜移植术后排斥反应、预防白内障术后发生后发性白内障(posterior capsule opacificatic， PCO)及葡萄膜炎等自身免疫性眼病。为了避免CsA全身用药的不良反应，同时达到长效、稳效的目的，对该药剂型的研究一直在不断深入[12]。本实验制备了CsA的缓释制剂，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography， HPLC)对不同给药剂量下兔眼房水中CsA的代谢特性进行了研究，为该药缓释微球的剂型研究和治疗后发性白内障提供科学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　Waters Alliance高效液相色谱仪(美国Waters公司)；MS1 Minishaker型涡旋振荡器(广州仪科实验室技术有限公司)；Anke TGL16G 型电动离心机(上海安亭科学仪器厂)；BF2000型氮气吹干机(北京八方世纪科技有限公司)。环孢霉素A缓释微球由天津药物研究所制备；环孢霉素A 对照品，纯度≥98.5%，为Sigma 公司产品；甲醇，系色谱纯，TEDIA公司产品；乙腈，色谱纯，TEDIA公司产品；其他试剂均为分析纯。新西兰大耳白兔由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 色谱条件

　　色谱柱：Century SIL C18BDS(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为乙腈水(67∶33)，流速为1.0mL/min，检测波长为210nm，柱温60℃。

　　1.2.2 缓释药物

　　环孢素微球(cyclosporine A， CsAMS)的制作方法是将含20g/L硬脂酸铝的豆油加热到140℃，以溶解分散固体，室温下冷却作为油相，用超声匀浆机将1g CsA干燥粉末分散于3125g油相中(含40g/L Span80)，得一极细S/O型混悬液，取1g混悬液倾入7g PLGAACN溶液(2816)中，分散形成S/O/O/O乳，将此乳喷入70g含1.5g/L Span 80的矿物油中，得S/O/O/O乳，400-500r/min下搅拌24h，挥干ACN，硬化的微球过50μm尼龙膜，先后用n己烷、20g/L Tween80水洗3次，减压干燥24h即得。微球平均粒径为63.22μm，跨距为1.57，载药量为7.50%，包封率为37.50%。

　　1.2.3 样品的处理

　　取0.2mL房水置1.5mL离心管中，加入600μL乙醚振荡1min萃取，分出有机层，重复萃取两次，合并有机相，在35℃用氮气吹干，残渣用200μL流动相溶解，9000r/min离心3min，吸取上清液进样测定。

　　1.2.4 标准曲线的制备

　　用空白房水配制质量浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.0、1.25mg/L的CsA溶液，按“样品处理”方法操作后分别吸取20μL依次按上述色谱条件进行测定。以CsA的配制浓度对峰面积做线性回归，绘制标准曲线。

　　1.2.5 回收率试验

　　用空白房水配制浓度分别为0.25、0.75、1.25mg/L的CsA标准溶液，按“样品处理”方法操作后，于同一天内上机测定5次，将峰面积代入标准曲线方程计算空白加样回收率。以峰面积比各浓度的CsA标准甲醇溶液测得的峰面积计算提取回收率。

　　1.2.6 精密度试验

　　用空白房水配制浓度分别为0.25、0.75、1.25mg/L的CsA标准溶液，按“样品处理”方法操作后，上机进行测定，连续测定3d，计算日内、日间的精密度。

　　1.2.7 样品的稳定性

　　精密配制低、中、高3种浓度的CsA房水溶液，分别置室温、-20℃和3个冻融循环条件下储存，按“样品处理”方法分别处理后测定样品的稳定性。

　　1.2.8 手术方法

　　复方托品酰胺充分散瞳，用盐酸氯胺酮和盐酸氯丙嗪2∶1混合液，按1-1.5mg/kg体重肌肉注射麻醉，0.4g/L倍诺喜滴眼液行表面麻醉，开睑器开睑，3.2mm穿刺刀做11-12点钟透明角膜切口，2点位作辅助切口，注入透明质酸钠，做连续环行撕囊，囊口3-4mm 直径大小，娩出晶体核。注入玻璃酸钠，囊袋内植入人工晶体(EP，美国AMO公司)。将含不同浓度药物及对照物的混悬液0.2mL注入囊袋内，结膜下注射庆大霉素1万单位及地塞米松2mg，用10g/L阿托品眼膏涂眼。所有操作由术者一人完成。

　　1.2.9 给药及样品采集方法

　　用12只健康新西兰白兔，雌雄各半，体重1.9-2.3kg，随机分为高、低两个给药剂量组，CsA缓释微球给药剂量分别为10mg和5mg。每只兔眼行晶体囊外摘除法，左眼前房及囊袋内注入CsA缓释微球，右眼注入相应的不含CsA的空白缓释微球为对照。于给药前和给药后24、48、72h，4、5、6、7、10、14、28d分别从每眼前房抽取房水200μL，于超低温冰箱中冷冻保存。测定时解冻，按“样品处理”方法操作后吸取50μL依次按上述色谱条件进行测定，将测得的峰面积代入标准曲线并换算出房水中的实际药物浓度。

　　1.3 统计学处理

　　药代动力学参数用DAS2.0程序处理，实验结果以±s表示。用SPSS10.0软件对所测实验数据进行处理，采用ANOVA进行药代动力学参数的统计分析。

　　2 结 果

　　2.1 系统的适用性

　　在选定的色谱条件下CsA的峰形良好，房水中的内源性物质均不影响CsA的测定，样品峰与杂质峰分离度大于1.5，理论塔板数均大于2400，CsA的保留时间为15.23min(图1)。

　　2.2 标准曲线与检测限

　　用标准曲线制备方法绘制得方程Y=77200X-9040， r=0.9951，CsA在0.13-1.25mg/L范围内呈良好线性关系，最低检测浓度0.13mg/L。

　　2.3 回收率与精密度
　　
　　低、中、高(0.25、0.75、1.25mg/L)浓度的CsA标准溶液测得的空白加样回收率为92.00%-99.20%，RSD均小于5%(n=5)，平均加样回收率为95.91%。标准溶液连续测定3d，测得的日内精密度为0.51%-3.28%，日间精密度为0.64%-3.18%，各浓度下的提取回收率平均为90.3%(表1)。表1 CsA回收率和精密度的测定结果（略）

　　2.4 样品稳定性

　　低、中、高3种浓度的CsA房水溶液在室温和-20℃储存，可分别保持24h和30d稳定，经3个冻融循环后稳定性良好。说明本实验建立的HPLC分析方法专属性强，准确性和重现性好，能够满足房水中CsA的分析要求。

　　2.5 释药性研究测定结果

　　CsA缓释制剂经兔眼前房给药后，在观测期间始终可测定到，代谢平稳，能在较长时间内维持有效浓度(图2)。

　　以DAS(drug and statistics，Ver 1.0)药动学软件处理药物浓度时间数据，权重为1，得不同给药剂量时的药动学参数(表3)。低剂量给药时的药动学参数为：药时曲线下面积AUC0∞=(111.88±8.32)mg/(h·L)，达峰浓度Cmax=(0.24±0.01)mg/L，消除半衰期t1/2β=(69.32±0.01)h，血浆清除速率CL=(13.67±0.82)mL/(h·kg)；高剂量给药时的药动学参数为：AUC0∞=(212.85±27.38)mg/(h·L)，Cmax=(0.42±0.04)mg/L，t1/2β=(69.32±0.01)h，CL=(14.17±0.18)mL/(h·kg)。高、低两种给药剂量下，CsA的t1/2Ka和CL经检验无统计学差异，AUC和Cmax与剂量之间线性相关。CsA的代谢符合二房室模型。缓释微球的释药速率适中，兔眼前房给药后可在2周内维持较高浓度。表3 兔眼房水中CsA的药动学参数（略）

　　3 讨 论

　　CsA在眼科最常用的剂型是滴眼剂，吸收主要依赖角膜的渗透进入房水。CsA是亲脂性化合物，能迅速透过角膜上皮，但其在眼内通透性较差，局部用药后CsA透过角膜进入眼内部组织的浓度较低，特别是后房组织如房水和玻璃体等，常规给药方式中50%-90%的药物因泪液引流和鼻咽黏膜吸收等因素影响而失去作用，药物的生物利用度低且作用时间短[3]。

　　微球(microspheres)是一种生物物理靶向载药制剂，直径在10-1000nm，是一种典型的介观系统，具有比表面积大、表面反应活性高、表面活性中心多、吸附力强等优点。可混悬于水性介质中，通过针头注射给药。微球药物载体技术以微球颗粒作为传递载体，将药物等治疗分子包裹其中或吸附其表面，运送到需要治疗的部位，同时也可在颗粒表面偶联特异性的靶向制剂，如单克隆抗体等，实现有效的主动靶向性[45]。微球的载体材料按其来源可分为天然高分子材料、半合成高分子材料及合成高分子材料。在合成高分子材料中，乳酸2羟基乙酸共聚物(PLGA)具有生物相容性好、生物降解可控且降解产物毒性低、缓释等优点[6]，因此为了延长药物的作用时间，将药物加入到缓释系统中，可使药物持续稳定释放，最大限度提高药物的利用度，有效抑制PCO的发生。理想的缓释制剂一般包括2个释药系统，一是快速释药部分，使药物迅速达到有效药物浓度而发挥治疗作用；二是缓释部分，维持平稳、均匀的有效药物浓度，长期发挥作用。本研究制备的环孢素缓释微球体内释放实验观察到药物在第1天有明显的突释现象，占总量的37.8%，考虑主要是微球表面吸附的药物短时间内从微球表面脱落，导致药物浓度急剧升高。这本身并不是微球内包裹的药物得以释放的结果。此后微球外液体逐步扩散到微球内部并携带药物从内部向外扩散，在较长时间内维持稳定的药物释放速度。后期微球中的聚乳酸逐步降解，达到一定程度时，促使药物从微球中全面加速释放，直至完全。
　　
　　本实验将CsA与乳酸2羟基乙酸共聚物(PLGA)制成CsA缓释微球，经一次给药后，可维持两周的有效浓度，释药速率适中，实现了亲脂性化合物CsA在眼部的持续稳定释放，有效增强CsA在眼局部用药的疗效，同时避免了CsA全身用药的毒副作用，对抑制白内障术后晶体上皮细胞的增生，预防后发性白内障的发生具有重要意义。该结果也证实环孢霉素缓释微球是一种释放特性优良的给药方式。尽管CsA缓释剂型的研究目前还主要处于动物实验阶段，但已显示出了良好的效果和优越性，为后发性白内障等眼科增殖性疾病的防治展示了光明的前景。

参考文献

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　　[2]马忠旭，张劲松，石树敏，等. 抗兔晶状体上皮细胞单克隆抗体与柔红霉素的偶联物的制备及其免疫学特征 [J]. 眼科新进展， 2003， 23(4):225228.

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　　[4]何颖，张尚权. 单抗与细胞毒药物化学交联的概况 [J]. 中国新药杂志， 1998， 7:423427.

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　　[6]Klose D， Siepmann F， Elkharraz K， et al. How porosity and size affect the drug release mechanisms from PLGA based microparticles [J]. Int J Phar， 2006， 314(2):198206.