七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血再灌注后MMP9和LN表达的影响

　　　　 作者：张韶华，韩文江，李晓蕾，王秀丽

【摘要】 　　目的 研究七叶皂苷钠(sodium βaescin)对大鼠局灶性脑缺血再灌注后基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9， MMP9)和层黏连蛋白(laminin， LN)表达影响，为深入探讨七叶皂苷钠对脑的保护机制提供实验依据。方法 制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，随机分为正常组、假手术组、缺血再灌注组和缺血再灌注七叶皂苷钠治疗组，后两组又分为缺血2h后再灌注3、6、12、24、72h和7d，共6个时间点，每时间点4只；用免疫组织化学法和图像分析观察其缺血区LN和MMP9的表达变化。结果 缺血再灌组MMP9在神经元的表达于再灌注6h开始增加，12h达高峰，24h又降低，7d最低，治疗组MMP9于再灌注同一时相有显著减少；LN在微血管的表达于再灌注12h明显减少，24h时达低峰，72h开始回升，治疗组在同一时相LN表达显著增多。结论 MMP9与LN可能参与脑血管源性脑水肿的形成发展，缺血再灌注早期七叶皂苷钠治疗通过减少MMP9的表达，增加LN的表达对缺血再灌注脑起保护作用。

【关键词】 七叶皂苷钠；基质金属蛋白酶9；层黏连蛋白；脑缺血再灌注；大鼠　

　　ABSTRACT: Objective To study the effect of sodium βaescin on the matrix metalloproteinase9 (MMP9) and laminin (LN) expression in rats after focal cerebral ischemia and reperfusion， and provide experimental evidence for the relationship of MMP9 and LN expression change with the neuroprotection of sodium βaescin. Methods The SpraqueDawley (SD) rat model of focal cerebral ischemia and reperfusion of cerebral middle artery was prepared. Fiftysix rats were randomly pided into the normal， sham， ischemia and reperfusion， as well as ischemia and reperfusiontreated with sodium βaescin groups. The latter two were further pided into six subgroups according to reperfusion time interval of 3h， 6h， 12h， 24h， 72h and 7d after brain ischemia， with 4 rats in each subgroup. Immunohistochemical staining and image analysis were used to measure the expression of MMP9 and LN in the ischemic region. Results The expression of MMP9 started to increase at 6h， reached the peak at 12h， decreased in 24h， and reached the lowest on 7d in cerebral ischemia and reperfusion group. The expression of MMP9 in the same time groups of the cerebral ischemia and reperfusiontreated with sodium βaescin group all obviously decreased (P<0.05). The expression of LN in the microvessels started to decrease at 3h， reached the lowest at 24h， and increased at 72h in the cerebral ischemia and reperfusion group. The expression of LN in the same time groups of the cerebral ischemia and reperfusiontreated with sodium βaescin group all elevated (P<0.05). Conclusion MMP9 and LN probably have a close relationship with the formation and progression of vascular brain edema. Sodium βaescin can help recovery of damaged brain by decreasing MMP9 expression and increasing LN expression in rats after early brain ischemia and reperfusion.

　　KEY WORDS: sodium βaescin; matrix metalloproteinase9; laminin; cerebral ischemia and reperfusion; rat

　　近年研究表明，基质金属蛋白酶9(matrix metallo proteinase9， MMP9)参与缺血或出血性脑损伤，主要是引起血脑屏障通透性增加和脑水肿，而层黏连蛋白(laminin， LN)则参与构成血管基底膜，对于维持血脑屏障的完整性起重要作用[1]，而且还有促进血管再生的作用[2]。七叶皂苷钠(sodium βaescin)因具有显著消肿、抗炎和改善血液循环作用，副作用较少[3]，新近开始用于减轻脑水肿等损伤，但其具体机制尚不十分清楚。本研究旨在用免疫组化法观察七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血再灌注后MMP9与LN表达的动态变化的影响，探讨七叶皂苷钠对缺血再灌注损伤脑的保护机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物、主要试剂与药品

　　清洁级健康雄性SD大鼠56只，体重230-250g，鼠龄8-10周，由哈尔滨医科大学第二临床医学院实验动物中心[证号SCXK(黑)20020002]提供。实验前饲养2d，常温，普通块料喂饲，自由进食饮水。术前12h禁食，自由饮水。皂苷钠粉针剂由山东绿叶制药股份有限公司提供，MMP9(BA0573)、LN(BA1761)一抗及二抗(BA1003)试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，BI2000医学图像分析系统由成都泰盟科技有限公司提供。

　　1.2 制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型

　　采用ZeaLong法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型：用10g/L戊巴比妥钠(40mg/kg体重)腹腔麻醉，颈部正中纵向切口，暴露左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，分离左侧颈总动脉，在靠近颈外动脉根部血管夹夹闭，在近心端结扎颈总动脉，血管夹夹闭其远端，并在结扎线与血管夹之间的颈总动脉上剪一小口，切口远端备线，打一松扣，将尼龙鱼线栓自小口插入，放开血管夹，经颈总动脉分叉处通过颈内动脉到大脑中动脉开口处，稍遇阻力即停止，插线长度约1.8-2.0cm(从分叉算起)，缚紧缺口远端的丝线，然后剪断线头，松开颈外动脉血管夹，缝皮，术毕。假手术组除不进线外，其余过程同缺血组。正常组不干预。再灌注组在缺血2h后轻轻抽出鱼线，使之退出到颈总动脉剪口处即可。

　　1.3 有效模型判定

　　参照longa神经功能缺陷评分标准：0分，无神经缺损症状，提起鼠尾，两前肢向地面伸展；1分，提起鼠尾，右前肢屈曲；2分，爬行时，向右侧旋转、划圈；3分，向右侧倾倒；4分，无自主活动伴意识障碍。其中1-4分为有效模型。

　　1.4 动物分组与给药

　　56只大鼠随机分为正常组(n=4)，假手术组(n=4)，模型组(缺血再灌注组，n=24)，治疗组(缺血再灌注七叶皂苷钠组，n=24)，其中模型组、治疗组再分为缺血2h后再灌注3、6、12、24、72h、7d亚组，每亚组4只。正常组、假手术组、模型组大鼠腹腔注射生理盐水1mL/d，治疗组大鼠腹腔注射七叶皂苷钠5mg/(kg·d)(药物用生理盐水稀释至1mL)。

　　1.5 动物处理及标本制备

　　在相应的时间点，麻醉动物，开胸暴露心脏，分离升主动脉，在右心耳处切开左心室，将注射器针头管插入主动脉内，先注入生理盐水致流出液澄清，再注入多聚甲醛，充分内固定后断头取脑，再采用相同的固定液外固定。自视交叉向前、后各取2.5mm左右的冠状脑切片，充分固定后常规脱水、透明、石蜡包埋，连续切片进行HE染色。

　　1.6 免疫组化染色

　　石蜡切片脱腊至水；微波抗原修复，室温自然冷却，0.01mol/L PBS冲洗；滴3mL/L h3O2室温20min，阻断内源性过氧化物酶，0.01mol/L PBS冲洗；滴血清封闭液，室温孵育10min，不冲洗；滴一抗MMP9(1∶100)；LN(1∶150)，阴性对照：滴0.01mol/L PBS代替一抗，4℃冰箱过夜，37℃复温30min，0.01mol/L PBS冲洗；滴生物素标记二抗(1∶100)室温孵育20min，0.01mol/L PBS冲洗；滴链霉菌抗生物素蛋白工作液，室温孵育10min，0.01mol/L PBS冲洗；DAB显色，充分水洗，苏木素染色30s；1min，充分水洗，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

　　1.7 结果观察和统计学方法

　　每只大鼠每个指标选1张切片，用医学图像分析系统对切片进行观察，取脑梗死灶边缘10个互不重叠视野，光镜下(×400)计数每个视野中的阳性细胞数。各组实验值以均数±标准差(±s)表示，用SPSS11进行方差齐性分析，然后t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 病理形态学观察

　　HE染色正常组与假手术组脑组织未见病理改变。模型组在缺血再灌3h可见梗死灶，主要位于左侧大脑皮质及基底核区，与周围分界清楚，中心区神经元及胶质细胞明显减少，残存神经元胞体缩小，胞核固缩、碎裂、溶解，尼氏体消失，胞质嗜酸性变，间质高度水肿，神经毡疏松，少量炎细胞浸润，边缘带间质水肿明显，见少量格子细胞。6-12h病灶中心区神经元及胶质细胞逐渐消失，边缘带水肿逐渐加重，24h达到高峰，72h边缘带水肿减轻，7d边缘带水肿最轻。治疗组梗死灶在同一时间点相同区域明显减小，边缘带残存的神经元较多，组织水肿明显减轻，血管周围间隙增宽，细胞肿胀，白质疏松化(图1)。

　　2.2 免疫组织化学观察

　　MMP9主要表达于神经胶质细胞胞质，呈棕黄色颗粒，与假手术组相比，缺血再灌6h时可见梗死灶边缘区MMP9的表达增多，12h达高峰，24h开始降低，7d最低；与模型组相比，治疗组在各相同时间点MMP9阳性细胞显著减少(图2，表1)。LN主要表达于微血管基底膜，呈棕黄色条索状，与假手术组相比，再灌注3h可见边缘区微血管的表达明显减少，24h达最低，72h开始回升；与模型组相比，治疗组在各相同时间点LN阳性微血管表达显著增多(图3，表2)。表1 模型组与治疗组MMP9表达的比较（略）表2 模型组与治疗组LN表达的比较（略）

　　3 讨 论

　　MMP9的合成与多种因子刺激有关。有研究表明，MMP9基因的启动子区含有一个激活蛋白1(activator protein 1， AP1)和核因子区，对多种炎性刺激都有反应，即早基因cfos和cjun的转录翻译产物Fos/Jun二聚体能结合MMP9的AP1启动子区域，TNFα、IL1β也能通过此途径作用于MMP9基因，氧自由基可作用于MMP9启动子的两个区域，诱导其转录。MMP9在细胞内合成，分泌到细胞外，激活后可以作用于Ⅳ胶原、LN、纤维连接蛋白成分并分解这些底物，因而MMP9可以破坏脑微血管基底膜，促进脑水肿[4]。但糖皮质激素可与Fos/Jun二聚体形成复合物，阻止其与AP1的结合，抑制MMP9基因转录[5]。我们发现MMP9表达于再灌注6h显著增加，24h达到高峰，可能与脑缺血再灌注初期局部炎性介质增多刺激MMP9基因转录，导致MMP9合成或激活增加有关。此与Magnoni等[6]研究结果比较一致。同时七叶皂苷钠治疗组在6、12、24、72h也明显低于模型组。七叶皂苷钠可能通过类激素样作用减轻水肿、抗炎，改善脑供血，减少MMP9的表达[78]。
　　
　　张微微等[9]研究发现，大鼠局灶性脑缺血再灌注24h时脑水肿及并发微血管出血最严重，72h微血管基底膜大片脱落、溶解、缺损；应用免疫组化法发现脑微血管基底膜主要成分LN抗原降至最低，其分布范围与脑水肿、微出血的量及程度成反比。该实验结果显示表达LN的脑微血管于12h明显减少，24h最低，故认为再灌注24h内发生的脑水肿与脑微血管基底膜损害有关，而基底膜的损害与LN的表达减少密切相关。而再灌注72h，LN表达的微血管数量回升，7d时最多，超出对照水平，可能因为LN具有参与内皮细胞之间的相互作用并促进内皮细胞分化、铺展而形成新的血管，促进病变脑组织的修复。在七叶皂苷钠治疗组，LN的表达于再灌注3、6、12、24h显著高于模型组相同时相，故认为七叶皂苷钠保护血脑屏障、减轻脑水肿也与LN表达增加有关，除可能因MMP9表达降低，LN的破坏减少，七叶皂苷钠是否可直接刺激LN表达增加尚未见报道。我们还发现LN在神经元也有表达，但比微血管表达弱，确切原因还不清楚。

　　本研究结果表明，MMP9表达增加和LN表达减少参与了缺血再灌注后脑微血管损伤及脑水肿形成和发展，此与Shunichi等[10]的研究结果较为一致。早期给予七叶皂苷钠治疗可能通过减少MMP9的表达，增加LN的表达对缺血再灌注脑损伤具有一定程度的保护作用。

参考文献

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　　[9]张微微，魏亚洲. 大鼠脑缺血/再灌注层黏连蛋白表达的试验研究 [J]. 北京医学， 2005， 27(7):408410.

　　[10]Shunichi F， Catherine AF， Takuma M， et al. Focal cerebral ischemia induces active protease that degrade microvascular matrix [J]. Stroke， 2004， 35:9981004.