长期应用糖皮质激素对大鼠股骨头骨组织OPG/RANKL mRNA表达的影响

　　　　 作者：王建忠，王坤正，时志斌，张明宇

【摘要】 　　目的 观察长期应用糖皮质激素对大鼠股骨头骨组织中骨保护素(osteoprotegerin， OPG)/核因子kappa B受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand， RANKL)mRNA表达的影响，探讨长期应用糖皮质激素导致股骨头坏死的另一作用机制。方法 健康SD大鼠40只，雌雄各半，随机分为低、中、高剂量激素组和对照组，每组10只。低、中、高剂量激素组动物分别给予肌肉注射醋酸泼尼松龙7、12.5、25mg/kg体重，每周2次；对照组给予相同体积生理盐水肌注。4周后取左侧股骨头骨组织石蜡包埋，HE染色，鉴定股骨头坏死情况；取右侧股骨头骨组织提取总RNA，采用实时定量聚合酶链反应(RTPCR)技术检测OPG和RANKL mRNA的表达水平并计算OPG/RANKL比值。结果 ①低、中、高剂量激素组和对照组动物初期股骨头坏死发生率分别为30%(3/10)、66.67%(6/9)、83.33%(5/6)、0(0/10)；②低、中、高剂量激素组和对照组动物股骨头骨组织OPG mRNA表达的相对量分别为1.12±0.17、0.96±0.16、0.83±0.18和1.60±0.49；RANKL mRNA表达的相对量分别为2.48±0.81、3.33±1.04、4.51±1.33和1.58±0.42。与对照组比较，3个激素组OPG mRNA表达降低，且与激素用量呈负相关，差异有统计学意义(P<0.05)；RANKL mRNA表达增高，与激素用量呈正相关，其中中、高剂量组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 长期应用糖皮质激素致股骨头坏死的效应可能与其调控OPG和RANKL mRNA表达有关。

【关键词】 糖皮质激素；股骨头；骨坏死；细胞因子

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effect of longterm administration of glucocorticoid on expression level of osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (RANKL) mRNAs in bone tissues of femoral head of rats， and discuss its mechanism of action on glucocorticoidinduced necrosis of femoral head. Methods Forty adult SD rats were randomly pided into 4 groups: lowdose glucocorticoid group (LD)， mediumdose glucocorticoid group (MD)， highdose glucocorticoid group (HD) and control group. The LD， MD and HD groups were treated by intramuscular injection of prednisolone 7， 12.5 and 25mg/kg body weight， respectively， and the control group was only treated by the same volume of sodium chloride. After 4 weeks intervention， osteonecrosis of left femoral heads was detected by HE staining， the right femoral head bone tissue total RNA was extracted and the expression level of OPG and RANKL mRNAs was examined by realtime quantitative polymerase chain reaction. Results ① The necrosis rate of femoral head was 30%(3/10)， 66.67%(6/9)， 83.33%(5/6)， and 0(0/10) in LD， MD， HD and control groups. ② The level of OPG mRNA was 1.12±0.17， 0.96±0.16， 0.83±0.18 and 1.60±0.49 in LD， MD， HD and control groups. The level of RANKL mRNA was 2.48±0.81， 3.33±1.04， 4.51±1.33 and 1.58±0.42 in LD， MD， HD and control groups. Conclusion The glucocorticoidinduced necrosis of femoral head may be related to the expression level of OPG/RANKL mRNAs regulated by glucocorticoid.

　　KEY WORDS: glucocorticoid; femoral head; osteonecrosis; cytokine

　　骨保护素(osteoprotegerin， OPG)和核因子kappa B受体活化因子配基(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand， RANKL)，直接影响着破骨细胞的分化及其功能，共同构成调节骨重建的横轴旁分泌系统，是大多数生物活性物质介导骨吸收的最终和共有通路。作为破骨细胞形成、分化和骨吸收的关键调节因子，OPG/RANKL系统在骨质疏松、骨硬化病、骨关节炎、骨肿瘤、Pagets病及牙周疾病等的发病机制及治疗方面的研究均取得了较大进展[18]。但关于OPG/RANKL系统在激素性股骨头坏死中的研究较少。基于此，本研究采用实时定量聚合酶链反应(realtime quantitative polymerase chain reaction， RTPCR)技术，观察糖皮质激素对大鼠股骨头骨组织中OPG/RANKL mRNA的表达水平的影响，探讨激素性股骨头坏死中的另一种可能途径。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　3月龄健康SD大鼠40只，雌雄各半，体重250-300g，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。

　　1.2 主要仪器与试剂

　　ABI 7000型Real timePCR仪为美国ABI公司产品；醋酸泼尼松龙由湖北制药有限公司提供；骨组织RNA提取试剂Trizol为美国Invitrogen 公司产品；逆转录多聚酶链反应试剂盒为立陶宛Fermentas公司产品；引物由大连宝生物工程有限公司合成。

　　1.3 动物造模、分组及药物处理

　　40只大鼠随机分为低、中、高剂量激素组和对照组，每组10只。低、中、高剂量激素组分别给予醋酸泼尼松龙7、12.5、25mg/kg体重肌注，2次/周；对照组按同样的方法给予相同容积的生理盐水。

　　1.4 组织学检查

　　用药4周后处死动物，取左侧股骨头，10%(体积分数)甲醛溶液固定，乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切成5μm厚切片，HE染色后，显微镜下观察，鉴定股骨头坏死情况。诊断标准参照2006年我国制定的股骨头坏死诊断和治疗的专家建议：骨活检显示骨小梁的骨细胞空陷窝多于50%，且累及邻近多根骨小梁，有骨髓坏死。

　　1.5 OPG/RANKL mRNA表达水平检测

　　采用Real timePCR仪检测大鼠骨组织中OPG和RANKL mRNA的表达水平。

　　1.5.1 骨标本总RNA的提取

　　处死大鼠，快速取出右侧股骨头，剔除软骨，置于盛有1mL Trizol的研磨器中仔细研碎并孵育5min，加氯仿沉淀，离心取上清。用等体积异丙醇沉淀RNA，离心去上清，75%(体积分数)乙醇洗涤，风干后用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解。电泳证实提取总RNA完整。

　　1.5.2 cDNA第1链的合成

　　取总RNA 500ng，随机引物1μL，加DEPC处理水补至12μL，70℃水浴5min，冰上冷却；加入反应缓冲液4μL，dNTP 2μL，RNA酶抑制剂1μL，混匀后25℃水浴5min；加反转录酶MMLV RNase 1μL，配制成20μL反应液。恒温水浴25℃ 10min，42℃ 60min，70℃ 10min，cDNA第1链合成，-70℃保存。

　　1.5.3 定量RTPCR检测

　　根据目的基因在GenBank中的己知序列，采用primer premier 5.0设计引物，引物序列见表1。选25μL反应体系，取SYBR Primix 12.5μL，ROX Reference Dye 0.5μL，上下游引物各0.5μL，模板cDNA 50ng，采用Real timePCR仪，用三步法进行PCR反应。反应条件均为预变性95℃ 35s，1个循环；变性95℃ 5s，退火58℃ 20s，延伸72℃ 35s，45个循环。通过ABI prism 7000 SDS 软件对各组目的基因作相对定量。并计算OPG mRNA 和RANKL mRNA的比值。表1 实时定量PCR的引物序列（略）

　　1.6 统计学处理

　　全部实验数据均采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。计量资料均数用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSDt检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠左侧股骨头的组织学表现

　　4周时，共有5只动物死亡，其中中剂量激素组1只，高剂量激素组4只。低、中、高剂量激素组及对照组动物出现初期股骨头坏死率分别为30%(3/10)、66.67%(6/9)、83.33%(5/6)、0(0/10)。正常股骨头切片HE染色可见骨小梁由板层骨构成， 绝大多数小梁骨陷窝内可见骨细胞，小梁间为血管和骨髓；股骨头坏死表现为大量不连续的骨碎片及骨髓坏死，碎片骨陷窝内骨细胞大部分消失，周围有大量炎性肉芽组织(图1)。

　　2.2 OPG、RANKL mRNA的表达及其比值

　　3个激素组与对照组比较，其OPG mRNA的表达水平降低， 且与激素用量呈负相关，差异有统计学意义(P<0.05)；RANKL mRNA表达增高，与激素用量呈正相关，其中中、高剂量激素组与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。3个激素组的OPG/RANKL比值较对照组明显降低，与激素用量呈负相关，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。表2 四组大鼠骨组织中OPG、RANKL mRNA的表达及OPG/ RANK比值（略）

　　3 讨 论

　　股骨头坏死是一种常见病，严重危害人民群众的健康和生活质量。我国每年新发股骨头坏死病例15-20万，累积需治疗的病例500-750万[9]，且一旦发生股骨头坏死，很难逆转。虽然近年的关节置换可以最终解决患者的行走问题，但由此也极大地增加了个体和社会的医疗成本。在股骨头坏死的病因中，糖皮质激素的应用是最主要的因素之一。在我国，激素性股骨头坏死约占非创伤性股骨头坏死的50%。5%-25%应用糖皮质激素的患者会发生股骨头坏死，在应用激素的SARS患者中，股骨头坏死发生率更高达53.5%[10]。在本研究中，随着激素用量的增加，股骨头坏死率明显增高。
　　
　　目前关于激素性股骨头坏死的发病机理的研究多集中在脂质代谢紊乱、血管内凝血、骨内高压、基因表达异常及骨质疏松等方面[1116]，而很少有关于OPG/RANKL系统在激素性股骨头坏死中的研究报道。OPG又称破骨细胞形成抑制因子，在骨组织中由成骨细胞及骨髓基质细胞产生。OPG为RANKL的饵受体，可竞争性结合RANKL，封闭RANKL与破骨细胞表面核因子kappa B受体激活子(RANK)结合，阻断破骨细胞的生成和活化，从而发挥其拮抗破骨细胞骨吸收作用。RANKL又称破骨细胞分化因子或RANK配体，主要由成骨细胞表达，通过旁分泌方式与破骨细胞前体或破骨细胞表面的RANK结合，促进破骨细胞的生成和活化。近年研究表明，OPG/RANKL系统在骨质疏松及其他骨代谢异常疾病中发挥重要作用。本研究结果显示，3个激素组大鼠骨组织中OPG mRNA表达较对照组明显降低，且与激素用量呈负相关；而RANKL mRNA表达较对照组增高，并与激素用量呈正相关。提示长期应用糖皮质激素导致骨组织中OPG表达下降和RANKL表达增高可能与激素性股骨头坏死的发生发展有关。成骨细胞表达OPG和RANKL是反向的调控。体内骨代谢平衡或失调，更多地取决于OPG/RANKL比值，而非OPG或RANKL的绝对量。本研究结果显示，3个激素组骨组织中OPG/ RANKL比值较对照组明显下降，且与激素用量和股骨头坏死率呈负相关，而激素用量与股骨头坏死发生率呈正相关。提示糖皮质激素可能通过下调OPG/RANKL比值来上调破骨细胞的活性，促进骨吸收，导致激素性股骨头坏死；或者先造成骨质疏松后，骨强度下降，骨小梁微骨折引起微血管的破坏，小梁间微循环中断，结合脂质代谢紊乱及凝血异常等机制，最终导致股骨头坏死。

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