作者：杨军，苏宝山，赵世平，强磊
【摘要】 目的 研制简单、快捷、使用方便的组织芯片仪，验证其性能。方法 根据组织芯片制备原理设计HT1型组织芯片仪，该组织芯片仪由阵列孔受体蜡块成型器、组织挖取器、负压包埋仪和操作支架组成。采用一次成型技术，仅一次操作即可快速制备所需的阵列孔受体蜡块；采用负压包埋技术，既可将组织样本精确定位并固定于同一水平面，又可迅速抽除组织样本与受体蜡块阵列孔间残留气泡。结果 使用HT1型组织芯片仪，可在数秒之内制备高质量阵列孔受体蜡块，构建一个容量为56例组织样本的TMAs蜡块仅需不到20min，且组织样本排列规则，无漂浮、倒伏和移位现象，也无气泡残留。经HE及免疫组织化学染色证实，组织芯片中组织样本排列规则、结构完整、背景清晰，脱片率低(<1.0%±1.1%)。结论 HT1型组织芯片仪是一款结构简单、使用方便、易于操作的高性价比组织芯片仪。
【关键词】 生物芯片；组织阵列(组织芯片)；组织阵列仪
ABSTRACT: Objective To design and develop a reliable， easetouse and cheap tissue microarryer for making tissue microarrays， and discuss its characteristics. Methods According to the facture procedure and principle of tissue microarray construction， HT1 tissue microarrayer was designed and developed. The tissue microarrayer consisted of a recipient paraffin block molding machine， a punch needle， a negativepressure embedding instrument， and a special manipulator. Using HT1 tissue microarrayer， the array holes in recipient paraffin block could be punched by singleshaping technique in one action in several seconds， while no chapping was guaranteed. During the TMAs paraffin block embedding process， the remnant air bubble between the tissue cylinders and array holes in recipient paraffin block could be exhausted rapidly and completely. Results Using HT1 tissue microarrayer， an array holes recipient paraffin block (several to several hundreds holes) could be made in several seconds. Several TMAs blocks with 56 tissue cylinders (1.5mm in diameter) were constructed easily and quickly within 20min. Under HE and immunostaining procedures， the tissue cores were well aligned， and orientation was properly done. The tissue cores on the slide maintained intact histological structure. The tissue structure and background of the HE and immunostaining were clear. There was less sample loss (the loss rate was less than 1.0%±1.1%). Conclusion HT1 tissue microarrayer is a simple， economical and high efficiency/cost (E/C) and easytouse device.
KEY WORDS: biochip; tissue microarray (tissue chip); tissue microarryer
组织微阵列(tissue microarrays， TMAs)，也称组织芯片(tissue chip， TC)，以其具有原位分析的特殊优势而成为病理学研究的新的技术平台[16]。TMAs已从手工制备发展到依赖半机械化和自动化组织芯片仪(tissue microarrayer)制备的水平。现有的TMAs制备策略和设备均采用单针打孔技术，因此，阵列孔受体蜡块常在制备过程中碎裂；此外，包埋过程中组织样本的漂移、倒伏、移位以及组织样本与阵列孔间残留空气形成的腔隙也严重影响TMAs质量。尽管一系列不同性能的组织芯片仪和辅助设备(http://www.chemicon.com; thhp://www.beecherinstruments.com)已被相继推出并应用[711]，但均未能弥补上述缺陷，却在很大程度上提高了TMAs的制备成本和使用门槛，使得大多中、小型病理研究机构望而却步，成为组织芯片技术发展的重要障碍之一。
为从根本上解决上述技术瓶颈和问题，本研究组研制出了一款成本低廉、操作方便、可适应不同实验要求、制作不同容量和大小组织芯片的HT1型组织芯片仪，通过本研究单位以及兰州、杭州、上海等多家单位使用，证明其效果良好。
1 材料与方法
1.1 系统设计 HT1型组织芯片仪由阵列孔受体蜡块成型器、组织样本挖取器、负压包埋仪和用于安装阵列孔受体蜡块成型器或组织样本挖取器的操作支架组成。
1.2 系统结构和工作原理
1.2.1 阵列孔受体蜡块成型器 阵列孔受体蜡块成型器由按照不同阵列方式规则固定于上下固定板上的不同规格的带有内芯的空心管(0.5～2.5mm)组成，通过一次操作即可制备出带有阵列孔的受体蜡块，同时，通过内芯与阵列空心管之间的相对运动，自动清除残留石蜡碎屑(图1)。
1.2.2 组织样本挖取器 组织样本挖取器由组织挖取针管和针芯组成，挖取针管可自动归位，通过与其针芯的相对运动自动推出挖取的组织(图1)。
1.2.3 负压包埋仪 负压包埋仪主要由包埋框、负压室、真空泵和温控台组成(图2)，用于制作受体蜡块和阵列组织石蜡蜡块(TMAs蜡块)的包埋。该包埋仪采用负压包埋技术，通过负压抽吸作用，既可抽除组织样本与受体蜡块阵列孔间腔隙中的空气，又能将供体组织样本原位固定于同一平面，减少组织样本的漂移、倒伏和移位现象的发生(图3)。
1.3 使用方法
1.3.1 阵列孔受体蜡块的制备 将阵列孔受体蜡块成型器安装在操作支架上。在操作台上制作厚约0.5～1.0cm的空白受体蜡块，待其凝固后，通过机械手柄的控制将阵列孔受体蜡块成型器的阵列空心管插入空白受体蜡块，然后轻轻抬起，通过一次操作即可获得阵列孔受体蜡块。这一过程常可在数秒之内完成，制备的阵列孔受体蜡块既可当即使用，也可室温保存备用。
1.3.2 挖取供体组织 将组织样本挖取器安装到操作支架上，参照供体蜡块HE切片，在供体蜡块上标记目标区[1，12]，通过机械手柄的控制将挖取针管插入供体组织，借助自动复位技术用针芯将挖取的圆柱形供体组织样本顶出，依次填入受体蜡块的阵列孔中并记录。
1.3.3 TMAs蜡块的制备 在负压包埋仪操作台上，将已填入供体组织样本的受体蜡块放入包埋框内并预热，打开真空泵开关并调节负压，将熔化的石蜡缓慢滴入包埋框，直至供体组织样本与受体蜡块阵列孔间腔隙内的空气被完全抽除并为熔化的石蜡填充为止，关闭负压开关和操作台开关，待其冷却，即可获得TMAs蜡块。
1.3.4 切片 按照常规病理切片技术，勿需特殊辅助设备，采用普通切片机即可制备出组织芯片。
1.4 应用 采用HT1组织芯片仪制备7×8(行×列)规格组织芯片(组织样本直径1.5mm，容量为56例)。供体组织蜡块由西安交通大学医学院第二附属医院病理科提供。按照上述方法制作TMAs。每50张抽取1张组织芯片行HE染色，以确保组织样本的完整性。选择适宜组织芯片行免疫组织化学染色检测P53蛋白的表达。所用试剂和方法如下：鼠抗人P53单克隆抗体(M7001)和Dako REALTM ElivisionTM Detection system试剂盒(Kit5007)均购自Dako公司(USA)，染色方法按照试剂盒说明进行。
2 结 果
使用HT1组织芯片仪，仅需数秒即可制备一个阵列孔受体蜡块，并能迅速抽尽组织样本与受体蜡块阵列孔间残留的空气，并将供体组织样本原位固定于同一平面，杜绝组织样本的漂移、倒伏和移位，获得高质量的TMAs蜡块。制备7×8规格TMAs蜡块(容量为56例)只需20min左右的时间。采用普通组织切片机，每一TMAs石蜡块，可制备200张以上5μm厚组织芯片，且组织样本结构完整、排列规则，很少出现组织样本丢失现象(样本丢失率低于1.0%±1.1%)(图4)。免疫组织化学染色组织芯片背景清晰、阳性结果可靠(图5)。
3 讨 论
阵列孔受体蜡块和TMAs蜡块的包埋是组织芯片制备过程中两个关键环节。阵列孔受体蜡块的制作是仅次于组织样本挖取工作的最为耗时、耗力，且成本高昂的工作。由于现有设备均采用单针打孔技术，必须多次打孔才能制备一个阵列孔受体蜡块，且稍有不慎便造成蜡块碎裂，故而费工费时，成品率低。为此，许多新型的组织芯片仪也被相继推出[1314]，甚至相继推出了系列价格不菲的自动化组织芯片仪(http://www.beecherinstruments.com)和相应的配套精确定位系统来完成这一繁琐的过程。但是，由于组织芯片的制备本身就是一项繁琐而耗力、耗时的劳动密集型的工作，自动化操作只占到完整组织芯片制备过程的5%，单纯提高组织芯片仪的自动化程度对于提高组织芯片制备效率的贡献十分有限，而且上述自动化设备和配套器具并未从根本上解决单针打孔制备受体蜡块的致命设计缺陷。因此，自动化组织芯片仪的应用并不能显著提高组织芯片的制备效率和实用性，相反，随着自动化程度的提高，设备成本和操作的复杂性随之大幅攀升(大多为数万美元)，使得拥有和使用这一技术的门槛也越来越高，将众多中、小型研究机构拒之门外。目前，居高不下的组织芯片仪价格已成为中小型实验室能否开展组织芯片研究的首要障碍，这十分不利于组织芯片技术的推广和发展[15]。
为了弥补上述致命缺陷，本研究组研制出了新型HT1型组织芯片仪。该组织芯片仪无需任何辅助设备和价格不菲的精确定位系统或自动化附件，最大程度降低了设备成本(仅2～3万人民币)。
HT1型组织芯片仪采用独特的阵列孔受体蜡块一次成型技术，从根本上完美解决了现有组织芯片仪采用单针打孔的致命技术缺陷，通过使用不同规格和排列组合的阵列孔受体蜡块成型器，使得阵列孔受体蜡块的制备过程一蹴而就。即使是未接受特殊培训的技术人员也能仅通过一次操作在数秒之内快速制备高质量阵列孔受体蜡块(阵列孔数目从数十个到数百，直径0.5～2.5mm)，并能完全杜绝受体蜡块在阵列孔制备过程中的碎裂现象，显著提高受体蜡块的质量和制备效率。这也是该组织芯片仪优于其他组织芯片仪的特征之一。
TMAs蜡块的包埋是组织芯片制备中的另一关键性环节。由于缺乏相应的解决方案和方法，对于大多数研究者而言，唯一可做的便是小心翼翼地完成TMAs蜡块的包埋。由于组织样本与石蜡的物理差异，在包埋过程中，组织样本常常出现漂移、倒伏、移位等现象，很难保证按照阵列孔排列的圆柱形组织样本准确定位并处于同一水平面；同时，组织样本与受体蜡块阵列孔间残留气泡形成的腔隙致使组织样本不能与受体蜡块完全融合，最终导致组织样本在切片过程中丢失。上述现象随着组织芯片容量的增加而频繁发生，严重制约组织芯片的质量和制备效率。尽管系列切片辅助设备(Instrumedics Inc， NJ， USA)已被应用，但并不足以弥补上述仪器设计之不足，收效甚微。而HT1型组织芯片仪采用了独特的负压包埋技术，通过调节、控制包埋温度和压力，既可将阵列组织样本原位固定于同一平面，减少组织样本的漂浮、倒伏和移位，又可完全抽除组织样本与受体蜡块阵列孔间腔隙内的空气并用熔化的石蜡填充，获得高质量TMAs蜡块。使用普通切片机和常规病理切片技术，勿需特殊辅助器具即可制备高质量的组织芯片，脱片率低于1.0%±1.1%，达到国内外商品化组织阵列仪性能。通过本研究单位以及兰州、杭州、上海等多家单位使用证实，HT1型组织芯片仪制备组织芯片性能可靠、是一款结构简单、使用方便、易于操作的高性价比组织芯片仪[5，16]。
总之，由于采用独特的阵列孔受体蜡块一次成型技术和负压包埋技术，HT1组织芯片仪在最大程度上降低了组织芯片制备的技术难度、劳动强度、设备成本和开展组织芯片研究的门槛，显著提高了组织芯片的质量和制备效率，是一款结构简单、使用方便、易于操作的高性价比组织芯片仪，可广泛应用于所有商业研究机构和不同规模的研究机构。使用该仪器，研究者可完全按照自己的设计随心所欲地在自己的实验室构建自己的组织芯片，这将更有利于推动组织芯片技术的发展和应用。
参考文献
[1]KONONEN J， BUBENDORF L， KALLIONIEMI A， et al. Tissue microarrays for highthroughput molecular profiling of tumor specimens [J]. Nat Med， 1998， 4(7):844847.
[2]VAN DE RIJN M， GILKS CB. Applications of microarrays to histopathology [J]. Histopathology， 2004， 4(2)4:97108.
[3]SHERGILL IS， SHERGILL NK， ARYA M， et al. Tissue microarrays: a current medical research tool [J]. Curr Med Res Opin， 2004， 20(5):707712.
[4]SKACEL M， SKILTON B， PETTAY JD， et al. Tissue microarray: a powerful tool for highthroughput analysis of clinical specimens [J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol， 2002， 10(1):16.
[5]杨军，王康敏，苏宝山，等. 应用组织芯片和ISH技术检测人体多种肿瘤中hTER mRNA和hTERT mRNA的表达 [J]. 西安交通大学学报(医学版)， 2002， 23(3):236238.
[6]SAUTER G， SIMON R， HILLAN K. Tissue microarrays in drug discovery [J]. Nat Revi Drug Discov， 2003， 2(12):962972.
[7]VOGEL UF， BUELTMANN BD. Simple， inexpensive， and precise paraffin tissue microarrays constructed with a conventional microcompound table and a drill grinder [J]. Am J Clin Pathol， 2006， 126(3):342348.
[8]HIDALGO A， PINA P， GUERRERO G， et al. A simple method for the construction of small format tissue arrays [J]. J Clin Pathol， 2003， 56(2):144146.
[9]PAN CC， CHEN PC， CHIANG H. An easy method for manual construction of highdensity tissue array [J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol， 2004， 12(4):370372.
[10]WANG L， DEAVERS MT， MALPICA A， et al. Tissue macroarray: a simple and costeffective method for highthroughput studies [J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol， 2003， 11(4):174176.
[11]崔万明，卞英伟，马路一，等. 便携式组织点样仪在肿瘤病理诊断中应用 [J]. 临床与实验病理学杂志， 2005， 21(5):620621.
[12]EGUILUZ C， VIGUERA E， MILLAN L， et al. Multitissue array review: a chronological description of tissue array techniques， applications and procedures [J]. Pathol Res Pract， 2006， 202(8):561568.
[13]DATTA MW， KAHLER A， MACIAS V， et al. A simple inexpensive method for the production of tissue microarrays from needle biopsy specimens: examples with prostate cancer [J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol， 2005， 13(1):96103.
[14]PIRES AR， ANDREIUOLO FDA M， DE SOUZA SR. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custombuilt needles [J]. Diagn Pathol， 2006， 25(1):1418.
[15]杨军，苏宝山，王康敏，等. 组织芯片研究领域中的几个基本问题 [J]. 中华病理学杂志， 2002， 23(6):7677.
[16]杨军，苏宝山，王康敏，等. 应用免疫组织化学方法评价组织芯片的可靠性 [J]. 西安交通大学学报(医学版)， 2005， 26(4):399402